免疫化学法测定生物化学物质

第二十九章

免疫化学法测定生物化学物质掌握激素、载脂蛋白及脂蛋白（a）、糖尿病相关激素及抗体等临床常用项目，免疫化学法测定的原理以及其方法的优缺点。熟悉肿瘤标志物、治疗药物等其他项目测定的方法原理与评价。了解免疫化学法测定生物化学物质的方法概述与进展。教学目标与要求

简介免疫化学技术ICS发光免疫测定技术荧光免疫法放射免疫测定技术酶免疫测定技术免疫比浊测定技术免疫化学技术（immunochemicalsystem,ICS）免疫化学技术：利用已知的抗原或抗体，检测相应的抗体或抗原。特点：高度特异性和高灵敏性。广泛应用于激素、蛋白质或多肽、肿瘤标志物、神经递质、核酸、心肌损害标志物等生化物质的测定。发光免疫法(luminescentimmunoassay)免疫学反应和发光技术相结合的产物，可以自动化检测微量的抗原或特异性抗体。类型：光致发光、酶促化学发光、电化学发光等。荧光免疫法将免疫学方法(抗原抗体特异结合)与荧光标记技术结合起来研究特异蛋白抗原在细胞内分布的方法。由于荧光素所发的荧光可在荧光显微镜下检出，从而可对抗原进行细胞定位。测定项目：ANA,dsDNA,AMA,ASMA和呼吸道病毒等。放射免疫测定技术（radioimmunoassay,RIA）以放射性核素作为示踪物的一种免疫标记技术。特点：高灵敏度、特异性强、重复性好应用：适用于各种抗原和抗体、微量蛋白质、激素、核苷酸、多肽等的定量测定。放射免疫分析免疫放射分析酶免疫测定技术

以酶标记的抗原或抗体作为主要试剂的免疫测定方法，在抗原抗体的特异性反应后，通过标记酶对底物的酶解呈色，根据呈色的深浅可以对相应抗体或抗原进行定性或定量的测定。酶放大免疫测定技术（enzymemultipledimmunoassaytechnique,EMIT）酶联免疫吸附试验（enzymelinkedimmunosorbentassay,ELISA）双抗体夹心法、双位点一步法、竞争法、捕获法等免疫比浊法利用抗原抗体复合物在液相中形成的浊度对入射光产生散射特性来测定抗原含量的一门技术。免疫散射比浊法免疫透射比浊法方法学评价抗原抗体反应特点（特异性、比例性、可逆性）优点：方法特异性好，灵敏度高，可达ng或pg水平。缺点：带现象：Ag与Ab比例不适而不出现可见反应。*前带(prozone)抗体过量时。*后带(postzone)

抗原过量时。第一节糖尿病相关激素和自身抗体测定一、胰岛素（In）和C肽（cp）（一）测定方法1.放射免疫法：原理：InI125+In+anti-In竞争结合测定结合部分（B）放射性强度。方法评价：特异性好、灵敏度高、试剂成本较低，但因受同位素半衰期影响，试剂盒寿命短，每次试验需同时作标准曲线，且自动化程度不高，有放射性污染，临床应用日趋减少。B、F分离2.发光酶免疫法测定In原理：In+anti-In*+羊抗人In-ALP分离洗涤

+AMPPD光量子强度与In量成正比。*-磁珠方法评价:灵敏，可批量检测，自动化分析。ALP3.电化学发光免疫法测CP原理：（双抗体夹心）三联吡啶钌-CP抗体+CP+生物素化CP抗体

链霉亲和素包被的磁性微粒吸附到电极

三丙胺（TPA）电化学反应。

磁场电场二、胰岛自身抗体

胰岛自身抗体主要有：胰岛细胞抗体(isletcellantibody，ICA)，谷氨酸脱羧酶抗体(glutamicaciddecarboxylaseautoantibody，GADA)，胰岛素自身抗体(insulinautoantibody，IAA)等。

蛋白酪氨酸磷酸酶抗体（IA-2A）锌转运体8（ZnT8）方法：间接免疫荧光法、放免法、ELISA、免疫印迹法和蛋白芯片法。临床意义在1型糖尿病出现临床表现之前就可以出现GAD抗体，在新诊断的1型糖尿病患者中GAD阳性率为75~90%，有助于1型糖尿病的及早诊断，尤其对LADA早期识别有重要价值。

ICA在新诊断1型糖尿病中阳性率为60~90%，随着病程延长而逐渐降低，ICA可用于LADA的诊断。IAA是可与胰岛素相结合的自身抗体可出现于未用外源性胰岛素和1型糖尿病以及临床前期患者中，在诊断的1型糖尿病患者中，IAA阳性率为40~50%，在LADA病人中也可检出IAA。锌转运体8(ZnT8)是新近发现的一种1型糖尿病自身抗原,具有高度β细胞特异性,通过影响锌离子浓度而在胰岛素合成和分泌中发挥重要作用。ZnT8自身抗体对自身免疫性糖尿病(尤其对其他自身抗体阴性者)有着重要的诊断与预测价值。1型糖尿病的及早治疗对于防止胰腺β细胞的进一步恶化至关重要。ZnT8Ab可帮助患者得到及时的诊断，并帮助更早的启动正确治疗。检测以上抗体有助于对糖尿病的正确分型以及指导治疗！（一）间接免疫荧光法测定ICA原理：

评价：阴阳性对照（二）放免法测定胰岛素自身抗体血清胰岛素水平可产生干扰。（三）ELISA测定胰岛素自身抗体免疫捕获法测定胰岛素抗体第二节血清载脂蛋白一、载脂蛋白AIApoAⅠ是ApoA族最多的一种组分，是HDL中的主要载脂蛋白。

【生物学变异】1．升高用抗癫痫药升高约20%、乙醇升高约20%、低血脂症升高约15%。在女性口服避孕药升高约10%、绝经约升高4%，雌激素约升高3%。2降低用促黄体生成素约降低3%。【病理学变异】动脉粥样硬化（尤指引起阻塞者）、糖尿病、高脂蛋白血症、肝功不足均可导致载脂蛋白A的降低。【医学决定性水平】0.5g/L：低于此值表明存在脂代谢紊乱和用于饮食治疗的观测。

【生物学变异】

20～60岁的年龄段约升高20%，肥胖（体重过载）升高，在女性用促黄体生成素可使结果升高19%左右。

运动降低约2%，素食降低约2%，低血脂症可减低10%左右，在女性雌激素约降低6%（亦有人报道降低30%），许多治疗药物，如：消胆胺（不影响VLDL）、安妥明、烟酸、右旋甲状腺素、门冬酰胺酶等均可导致载脂蛋白B的降低。

【病理学改变】

1．增加高脂蛋白血症、糖尿病、动脉粥样硬化、心肌梗塞。

2．减少见于心肌局部缺血和肝功不全。

【医学决定性水平】

1.60g/L:高于此限存在脂代谢紊乱并用于饮食治疗的观察。

apoB方法概述：方法有免疫比浊法、ELISA、火箭免疫电泳法和免疫扩散法等。ELISA法定量分析的精密度比其他免疫化学定量法比较差，免疫比浊法是最常用的。

1.测定原理

特异性抗体与载脂蛋白的浊度反应

多点校准，曲线拟合。（采用Logit-Log模式）

免疫透射比浊法测定ApoAI或ApoB2.性能：

抗血清的纯度和效价：抗ApoAI>1:16~32；抗ApoB>1:128抗原抗体比例合适性：标本1:20预稀释，或者效价提高，抗ApoAI=1:32；抗ApoB=1:256.校准血清定值：现在已有WHO认可的由美国西北脂类研究室根据国际临床化学会的计划研制的ApoAI参考血清（SP1-01）、ApoB参考血清（SP3-07），常规工作用校准血清应溯源于这两种参考血清抗原位点的暴露：使用表面活性剂有助于抗原位点的暴露，还能减轻标本空白的浊度，如PEG6000主要干扰：血清本身的混浊（如高脂血症）可作标本空白管，或采用两点法除去空白。

二、LP(a)

Lp(a)既有ApoB100又有特征性载脂蛋白Apo(a)，加之Apo(a)的分子量变异较大故Lp(a)测定方法难度较大。增高：见于动脉粥样硬化性心脑血管病、急性心肌梗死、家族性高胆固醇血症、糖尿病、大动脉瘤及某些癌症等。减低：见于肝脏疾病、酗酒、摄入新霉素等药物后。免疫比浊法测定原理Lp(a)的单克隆抗体与Lp(a)产生浊度反应多点校准，曲线拟合测定方法评价灵敏度高，能自动化免疫检测法被临床广泛应用Apo(a)多态性，准确度不好，难以标准化多态性是指在一个生物群体中，同时和经常存在两种或多种不连续的变异型或基因型（genotype）或等位基因（allele），亦称遗传多态性（geneticpolymorphism）或基因多态性。从本质上来讲，多态性的产生在于基因水平上的变异，一般发生在基因序列中不编码蛋白的区域和没有重要调节功能的区域。对于一个体而言，基因多态性碱基顺序终生不变，并按孟德尔规律世代相传。

生物群体基因多态性现象十分普遍，其中，人类基因的结构、表达和功能，研究比较深入。人类基因多态性既来源于基因组中重复序列拷贝数的不同，也来源于单拷贝序列的变异，以及双等位基因的转换或替换。按引起关注和研究的先后，通常分为3大类：DNA片段长度多态性、DNA重复序列多态性、单核苷酸多态性。

SNP

第三节心肌蛋白和利钠肽测定一、肌红蛋白（乳胶增强免疫比浊法测定肌红蛋白）原理：聚苯乙烯乳胶颗粒包被抗体，与肌红蛋白发生抗原抗原反应，产生交联凝集，其浊度深浅与量成正比。肌红蛋白（Myoglobin,Mb）是一种氧结合血红素蛋白，主要分布于心肌和骨骼肌组织。在急性心肌损伤时，Mb最先被释放入血液中，在症状出现约2-3小时后，血中Mb可超出正常上限，9-12小时达到峰值，24-36小时后恢复正常。对于怀疑ACS的病人建议连续采样测定，因为症状出现和蛋白标志物释放到血液之间有一段延迟。在ACS早期诊断和监测的临床效用已有大量文献报告。Mb阴性有助于排除心梗。

临床意义：

测定血清肌红蛋白肌红蛋白可作为急性心肌梗死(AMI)诊断的早期最灵敏的指标。但特异性差,骨骼肌损伤、创伤、肾功能衰竭等疾病,都可导致其升高。Mb阳性虽不能确诊AMI,但可用于早期排除AMI诊断的重要指标,如mb阴性,则基本排除心肌梗死

,还可用于再梗死的诊断,结合临床,如Mb重新升高,应考虑为再梗死或者梗死延展。

肌红蛋白二、肌钙蛋白I

1.胶体金层析法----定性原理：以硝酸纤维素膜作为固相载体、包被抗原或抗体；利用微孔滤膜渗滤特性可使抗原或抗体与膜表面的固相抗体或抗原结合、聚集，形成紫红色斑点；微孔滤膜渗滤特性可完成洗涤过程，实现游离标记物的分离；技术原理2.化学发光免疫法测定cTnI----定量

原理：双位点夹心法cTnI抗体-顺磁性微粒+cTnI+吖啶酯-cTnI抗体+H2O2+NAOH化学发光当心肌损伤后，心肌肌钙蛋白复合物释放到血液中，4-6小时后，开始在血液中升高，升高的肌钙蛋白I能在血液中保持很长时间6-10天。肌钙蛋白I具有高度心肌特异性和灵敏度，所以肌钙蛋白T已成为目前最理想的心肌梗死标志物。检查时：不同厂家试剂盒对标本的要求也不同，应按要求取血。不适宜人群：严重的溶血将影响测定结果。患有严重骨骼肌损伤病人会产生假阳性。三、利纳肽（电化学发光法测定利钠肽）原理：（竞争法）血浆利钠肽铕-利钠肽抗体竞争性结合生物素-利钠肽+链霉亲和素-磁性微粒电极光信号方法评价：利钠肽稳定性差，快速分离，加抑肽酶防止降解。捕获电场心钠肽主要由心房肌细胞分泌，脑钠肽主要由心室肌细胞分泌，C型利钠肽主要由血管内皮细胞分泌并在局部发挥血管扩张和抗增殖作用。血浆心钠肽具有扩血管、利尿、拮抗神经内分泌激素的多种作用。

临床意义：

由于心房扩张是ANP释放的主要诱因，因此ANP的浓度与左心房压、肺动脉收缩压有着密切的关系。

1.升高：见于原发性高血压、冠心病、心力衰竭、室上性心动速、早搏肝硬化、支气管哮喘、慢性阻塞性肺病、醛固酮增多症、肾病。在急性心梗，ANP的升高对左心室功能障碍和AMI的死亡率由独特的预报价值，急性心肌梗死患者在亚急性期ANP的浓度升高提示长期预后差。

2.降低：见于甲状腺功能亢进、心房纤维性颤动。

ANP实际上它主要来源于心室。BNP具有促进排钠、排尿，具较强的舒张血管作用，可对抗肾素-血管紧张素-醛固酮系统（RAAS）的缩血管作用，同ANP一样是人体抵御容量负荷过重及高血压的一个主要内分泌系统。心功能障碍能够极大地激活利钠肽系统，心室负荷增加导致BNP释放。

测定血浆BNP浓度可以为临床提供许多有用的信息，常用的方法主要有：放射免疫法（IRA）、免疫放射测量法（IRMA）、电化学发光法（ECLA）。

意义：

CHF患者血浆BNP浓度较正常升高，且与心衰严重程度呈正比，比较正常组和CHF组之间的心脏及血浆BNP水平，发现正常人心室BNP含量为心房的7.2%，整个心脏的30%，CHF患者则分别上升为22%、52%脑钠肽（BNP）第四节激素测定一、促甲状腺素（时间分辨荧光免疫法测定促甲状腺素）原理（双抗体夹心法）：

TSH+TSH-Ab*抗原抗体复合物延迟时间检测荧光强度TSH-Eu3+解离增强液时间分辨荧光免疫分析

（time-resolvedfluoroimmunoassay,TRFIA）特点：使用三价镧系元素作为示踪剂，其经紫外光激发所发出的荧光衰变时间长，利用延迟测光时间，可有效消除样品或试剂中蛋白质的非特异荧光的干扰激发光和荧光的波长移位大，荧光光谱峰窄，可有效消除激发光的干扰。三碘甲腺原胺酸（3,5,3′-triiodothyronine,T3)甲状腺素（thyroxine,T4)FT3FT4二、甲状腺激素三、甲状腺相关疾病抗体甲状腺微粒体抗体（TMAb）甲状腺过氧化物酶抗体（TPOAb）甲状腺球蛋白抗体（TGAb）促甲状腺素受体抗体（TRAb）甲状腺球蛋白（Tg）四、性腺激素PRL、FSH、LH、E、T、PROG促甲状腺激素受体抗受体抗体（TRAb）又称膜受体抗体，是直接作用于甲状腺细胞膜上的TSH受体的抗体，属免疫球蛋白IgG，根据其作用可分为以下3类：①甲状腺刺激性抗体（TSAb），又称甲状腺刺激免疫球蛋白（TSI），与甲状腺滤泡膜上的TSH受体结合，刺激甲状腺肿大，增强其功能活性，是导致Graves病的主要病因。②甲状腺功能抑制性抗体（TFIAb）：又称甲状腺功能抑制性免疫球蛋白（TFII），与TSH受体结合后，可抑制甲状腺功能，引起甲低。③甲状腺生长刺激免疫球蛋白（TGI）：可刺激甲状腺肿大，但不影响其功能。