第六章一般毒性36

第六章化学毒物的一般毒性作用

（commontoxicityofchemicalpoison)1【目的要求】掌握一般毒性作用的概念、试验目的熟悉一般毒性试验方法要点熟悉亚慢性毒性试验方法了解蓄积毒作用概念2【内容】急性毒作用：概念、试验目的、试验方法的要点、分级和评价蓄积毒作用：概念亚慢性毒作用：概念、目的和方法要点慢性毒作用：概念、目的、方法要点和注意事项3毒理学主要三大研究领域描述毒理学（Descriptivetoxicology）机制毒理学（Mechanistictoxicology）管理毒理学（Regulatorytoxicology）

4毒理学研究方法整体动物试验(invivo)体外试验（invitro)人体观察（HumanToxicology)流行病学研究(EpidemiologicalStudy)一般毒性试验特殊毒性试验急性亚急性亚慢性慢性皮肤和眼刺激性致敏性等致突变致畸致癌发育与生殖毒性离体器官：心、肝、肺、肾、脑细胞：原代细胞、细胞株、细胞系细胞器：线粒体、微粒体、胞核临床毒理学研究：中毒事故的处理或治疗志愿者研究：低浓度、短时间、可逆性描述流行病学研究：提出病因假说分析流行病学研究：验证病因假说，明确因果关系5外源化学物的一般毒性作用一般毒性作用也称基础毒性，是全身各系统对外源化学物的毒作用反应，与特殊毒性（致畸、致突变、致癌）相对而言。6根据接触毒物的时间长短，一般毒性作用分为急性毒性重复剂量毒性（亚急）亚慢性毒性慢性毒性根据毒物接触时间长短所进行的观察和评价毒效应的试验分为急性毒性试验重复剂量毒性试验亚慢性毒性试验慢性毒性试验7能够进入人类生态环境和人密切接触的物质，特别是新化学物，均需对其进行一般毒性作用的观察和评价。包括新的食品、药品、农药、化妆品、工业化学品（消毒剂）等。8化学毒物一般毒性作用的研究对防治外源化学物所致急慢性中毒，对毒理学安全性评价和危险度评定，制订卫生标准以及管理毒理学的决策方面均具有十分重要的意义。9第一节急性毒性作用

（acutetoxicity)10一般毒性评价方法以哺乳动物体内试验为主。急性毒性作用是毒理学研究中最基础的工作，是了解外源化学物对机体产生急性毒性的主要依据，急性毒性试验是毒理学安全性评价的第一步。在不同类型化学品的法规程序中通常是必做试验。11急性毒性：是指机体(人或实验动物)一次或24小时内多次接触外源化学物后在短期内所产生的毒性效应包括一般行为、外观改变、大体改变及死亡效应，最主要观察指标是LD50

一、急性毒性的概念12中毒效应出现的时间：化学物使实验动物发生中毒效应的快慢和剧烈的程度，可因所接触的化学物的质与量不同而异有的化学物在实验动物接触致死剂量的几分钟之内，就可发生中毒症状，甚至死亡而有的化学物则在几天后才显现中毒症状和死亡，即迟发死亡13二、急性毒性试验的目的1.测试和求出受试化学物的致死剂量(通常以LD50为主要参数)，并对该外源化学物进行急性毒性分级142.通过观察动物中毒作用表现、毒作用强度和死亡情况，初步评价毒物对机体的毒效应特征、靶器官、剂量－反应关系和对人体产生损害的危险性3.为后续的重复剂量、亚慢性及慢性毒性试验研究以及其他毒理试验提供接触剂量和观察指标选择的依据154.为毒作用机理研究提供线索，了解中毒效应的特征（包括症状的，生理的，生化与组织病理损伤）5.研究化学物急性中毒诊断、预防和急救治疗措施16三、经典的急性毒性试验方法要点

实验动物染毒途径染毒剂量观察周期观察指标的选择计算方法和评价经典的急性毒性试验以死亡为其观察终点，如概率单位法、改进寇氏法和霍恩法17尽量选择对化合物毒性反应与人近似的动物；易于饲养管理，试验操作方便；繁殖生育力较强，数量较大能够保障供应；易于获得、品系纯化，且价格较低的动物。为了有利于预测化合物对人的危害，要求选择两种以上的实验动物，最好一种为啮齿类，一种为非啮齿类，分别求出其急性毒性参数。在几种常用的哺乳动物中，大鼠为首选的啮齿类动物。(一)实验动物选择181.实验动物的选择研究内容实验动物急性毒性免疫毒性放射病吸入性粉尘药物对皮肤局部作用实质性脏器的毒作用迟发性神经毒慢性毒性致畸性致突变性、致癌性大、小鼠大、小鼠、最常用C57BL/6狗、大、小鼠，不宜用兔大鼠家兔、豚鼠小鼠来亨鸡大鼠、狗大、小鼠、家兔大、小鼠19昆明小鼠NIH小鼠ICR小鼠BALB/c小鼠BALB/c-nu裸小鼠20金黄仓鼠豚鼠Wistar大鼠21新西兰兔Beagle犬来亨鸡巴马香猪22恒河猴23动物种类成年体重选择范围(g)生活年限(年)时间（月）体重(g)急性试验慢性试验小鼠1.5～221518～2510～15大鼠2～2.53150180～24050～100豚鼠6～83250200～250150～200兔4～93～415002000～25001200～1500猫10～123～415001500～25001000～1500狗15～203～4100008000～150004000～80002.实验动物的生活年限及体重选择243.性别急性毒性试验所用的动物应当是雌、雄各半如果在研究中发现待测化学物对雌、雄动物的毒性大小有明显差异时，应分别求出雌性与雄性动物各自的LD50值如果试验是为致畸试验作剂量准备，也可仅做雌性动物的LD50试验25在利用不同的方法测定化学物LD50时，实验设计中对动物数的要求不同4．实验动物分组和数量霍恩氏法测LD50时要求有4个剂量组，每组5只动物，雌雄各半

26概率单位法、Bliss法测定则要求5—7个剂量组，每组10只动物或10只以上

对于不同的化学物测定应根据其相应的试验规程确定实验动物数量27动物分组：均衡性和随机性均衡性：要求各组动物的平均体重及体重的离散度尽可能一致。具体来说是（1）实验动物的体重不应超过全体实验动物平均体重的20％---控制离散度（2）每组之间的平均体重相差不应超过10％---控制均衡性285.实验动物的预检：适应性饲养一周，选择健康的动物适应环境筛检动物随机性：（随机分组）每只动物分散到各组去的机会是均等的，以避免成见或系统误差29实验动物喂养环境：实验动物喂养室室温应控制在223℃，家兔可控制在203℃，相对湿度30%～73%，无对流风。每笼动物数以不干扰动物个体活动及不影响试验观察为度，必要时需单笼饲养。饲养室采用人工昼夜为好，早6点至晚6点进行12小时光照，其余12小时黑暗，一般食用常规试验室饲料，自由饮水。306.给药前禁食处理凡经口染毒时，要求试验前要对动物禁食，以保证胃内无食物，减少食物对化学物毒性的干扰禁食时间:隔夜禁食禁食不禁水经口多次可不禁食31

(二)受试物及处理受试物的接受、分样、保管、称重、配制以及在此过程中严格的质量保证影响急性毒性试验受试物的化学结构、纯度、杂质、理化性质特别是挥发、溶解性等。受试物一般应临用前新鲜配制，除非已证明溶液贮存是稳定的。

受试物剂型：水溶液、混悬液、油溶液32

(三)染毒方法模拟人在生活和生产环境中实际接触该受试物的途径和方式工业化学毒物：经呼吸道、经皮农用化学物：经口、经皮、经呼吸道药品：经口、经注射食品：经口环境污染物：经口、经呼吸道、经皮吸收速率：静脉注射>吸入>肌注>腹注>皮下注射>经口>皮内注射>经皮331.经口(胃肠道)染毒(灌胃，喂食，胶囊）（1）灌胃（等容量灌胃法）狗的灌胃3435空腹灌胃后2-3h复食灌胃的体积不超过体重的1-2％：小鼠为0.21.0ml/只或0.10.5ml/10g较合适

大鼠为5ml/只(通常用0.51.0ml/100g）

家兔为10ml/2kg体重，狗不超过50ml/10kg362.经呼吸道接触在常温、常压下为气态，或在生产过程中和生活过程中以蒸气、气溶胶、烟、粉尘状态污染生产与生活环境空气，此时就有可能经呼吸道吸入静式吸入：将动物置于一定体积的密闭容器内，加入定量的易挥发的液态化合物或一定体积的气态化合物，在容器内形成所需要的受试化合物浓度的空气环境。

动式吸入：动物处于空气流动的染毒柜中，染毒柜装置备有新鲜空气补入与含受试化合物空气排出的动力系统和随时补充受试化合物的配气系统。373.经皮肤染毒

研究外源化学物经皮肤吸收应当尽量选择皮肤解剖、生理与人类较近似的动物为对象，目前多选用家兔和豚鼠但由于研究化学物经皮肤吸收的毒性(求经皮LD50)所需的实验动物较多，使用家兔、豚鼠不够经济，也常用大鼠代替38经皮肤染毒程序给予受试物前24h，确定受试部位机械或化学脱毛面积10%～15%体表面积检查去毛部位有无异常现象单位体重相同容积染毒，接触时间与人实际接触该化学物的时间相仿394.经注射染毒常用实验动物给予受试物的体积(ml)注射方式小鼠大鼠豚鼠兔狗腹腔0.2～1.01～32～55～105～15肌肉0.1～0.20.2～0.50.2～0.50.5～12～5静脉0.2～0.51～21～53～105～15皮下0.1～0.50.5～10.5～21～33～1040外源化学物LD50时设置几个剂量组较为合适，应依预试验结果而定一般设置57个剂量组即可，它即符合统计计算要求又可节省人力和财力。每个剂量组的动物数，小鼠不少于10只、大鼠68只、家兔46只最大剂量法：以最大容积最高浓度给予动物后未见死亡，可不进一步试验求出LD50值。41（五）毒性作用观察1.中毒体症和发生过程观察（P123）很多化学物在实验动物接触的初期往往先出现兴奋现象，有的化学物在动物接触的初期首先表现为抑制现象

通过毒性表现可初步确定急性毒性靶器官422.死亡情况和时间分布：计算LD503.体重：在观察期间应注意观察其体重变化。这有助于了解受试化学物所致的中毒效应是短暂的或较长期的效应434.病理检查和其它指标观察应当重视病理组织学检查凡中毒死亡动物应及时解剖做病理学检查，检查器官有无充血、出血、水肿或其它改变，并对有变化的脏器作病理组织学检查对存活动物于观察期结束后应做病理学检查

44(六)观察时间和周期

测定外源化学物的LD50(LC50)，一般要求计算实验动物接触化学物之后两周（14天）内的总死亡数对于一些速死性化学物求其LD50(LC50)也可仅计算24小时的死亡率45四、急性毒性分级和评价急性毒性试验主要目的之一是对化学物的急性毒性进行分级，评价化学物的急性毒性强弱，用于比较其急性毒性大小。WHO于2003年公布《全球化学品统一分类和标签制度》（GHS），2005年修订，2008年GHS将全面实施。GHS对急性毒性分级以LD50/LC50值为依据划分。46WHO急性毒性分级毒性分级大鼠一次经口LD50（mg/kg）剧毒<1高毒1~中等毒50~低毒500~实际无毒5000~47五、急性毒性替代试验固定剂量法Fixeddoseprocedure不以动物死亡作为观察终点急性毒性分级法Acutetoxicclassmethod以死亡为终点的分阶段试验法上-下移动法Up/downmethod以死亡为终点但也可用于观察不同的终点48第二节局部刺激试验49局部刺激试验（localirritationtest)目的是了解外源化学物对皮肤、眼睛的局部刺激性和腐蚀性，包括眼刺激、皮肤刺激试验。试验结果可为制定化学物对眼睛和皮肤防护措施提供依据。我国农药、化妆品和消毒剂毒理学试验程序均规定局部刺激试验为必做项目。局部刺激试验50一、眼刺激试验眼原发性刺激试验观察终点为眼刺激和眼腐蚀。眼刺激试验推荐方法是Draize试验。使用家兔4只，滴眼后观察结膜、角膜和虹膜的反应，按规定的分级标准进行评分，一般观察期为7天。51二、皮肤原发性刺激试验皮肤原发性刺激试验包括单次和多次皮肤刺激试验，完整皮肤和破损皮肤刺激试验等。观察终点为皮肤刺激和皮肤腐蚀。皮肤刺激评价方法称Draize试验。皮肤刺激试验常用动物为家兔和豚鼠。在不同时间里观察涂抹部位皮肤反应，皮肤反应的表现为红斑，损伤最重的可形成焦痂，一般按红斑和水肿的严重程度评分。观察时间的长短应足以观察到可逆或不可逆刺激作用，一般不超过14天。52三、皮肤致敏试验皮肤致敏：又称致敏性接触性皮炎，是一种化学物免疫介导的皮肤反应，人体反应的特点为瘙痒、红斑、水肿、丘疹、水疱等。皮肤致敏试验的目的是通过动物试验预测化学品经皮肤接触对人类引起皮肤致敏反应的危害。53皮肤第一次接触外源化学物产生较轻的反应或无明显反应，经过一段时间（几周或几年）再次接触，会引起迟发性超敏反应（接触性皮炎），且在最初染毒部位以外的皮肤均可发生。皮肤超敏反应试验常选择豚鼠，试验分诱导接触（inductionexposure)和激发接触（challengeexposure）。54诱导接触是以较低或中等浓度受试物对皮肤重复染毒（涂皮或皮下注射），一般需14天。间隔10-14天后，到激发阶段，用激发剂量（低于诱导剂量）受试物未染过毒的皮肤部位，观察24、48和72小时后有无皮肤反应，以皮肤反应的严重程度来评分。55第三节短期、亚慢性

和慢性毒性作用56人类接触化学物的方式往往是长期的、重复的、低水平的，不会发生急性毒作用。长期重复剂量染毒和一次剂量染毒所致毒作用可能完全不同，因此，用急性毒性资料难以预测慢性毒性。重复剂量毒性试验（亚急性）亚慢性毒性试验慢性毒性试验一、概述57蓄积作用（accumulation)：外源化学物连续地、反复地进入机体，而且吸收速度或总量超过代谢转化与排出的速度或总量时，化学物就有可能在机体内逐渐增加并贮留的现象。（一）、蓄积作用58蓄积作用是发生慢性中毒的物质基础一种外源化学物有无蓄积作用是评定该化学物是否可能引起潜在慢性中毒的论据之一，也是制定卫生限量标准时安全系数的一种依据59物质蓄积（materialaccumulation)：实验动物反复多次接触化学物后，用化学分析方法能够测得机体内存在该化学物或其代谢产物功能(机能)蓄积（functionalaccumulation)：有的化学物在长期接触后，机体内虽不能测出其原型或代谢产物，却出现了慢性毒性作用60（二）短期重复剂量毒性作用、亚慢性毒性和慢性毒性作用的基本概念短期重复剂量毒性是指实验动物或人连续接触外源化学物14-30天所产生的中毒效应。亚慢性毒性（subchronictoxicity）是指实验动物或人连续较长期（相当于生命周期的1/10）接触外源化学物所产生的中毒效应。慢性毒性（chronictoxicity）是指实验动物长期染毒外源化学物所引起的毒性效应。61短期重复剂量毒性试验、亚慢性毒性和

慢性毒性作用的目的1.观察长期接触受试物的毒性效应谱，毒作用特点和靶器官。了解其毒性机制。2.研究重复接触受试物的剂量-反应（效应）关系，确定其观察到有害作用的最低剂量（LOAEL）和未观察到有害作用的剂量（NOAEL），为制定人类接触的安全限量参考数值3.观察长期接触受试物毒性作用的可逆性。4.确定不同动物对受试物的毒效应的差异，为将研究结果外推到人提供依据62二、研究方法重复剂量毒性试验、亚慢性毒性试验和慢性毒性试验在设计和评价上有许多共同之处，亚慢性毒性试验是长期重复试验中最常用的，以该试验为重点介绍其研究方法。631、实验动物的选择亚慢性毒性作用研究一般要求选择两种实验动物，一种为啮齿类，另一种为非啮齿类，如大鼠(Wistar,Sprague-Dawley)和狗（Beagle犬），以便全面了解受试物的毒性特征64由于亚慢性毒性试验期较长，所以选择被动物的体重(年龄)应较小（离乳不久动物），如小鼠应为15g左右，大鼠100g左右65实验动物分四级：普通动物（Conventionalanimal,CV）、清洁动物（Cleananimal,CLorCleanconventionalanimal，CCV）无特定病原体动物（Specificpathogenfreeanimal,SPF）、无菌动物（Germfreeanimal,GF），亚慢性毒性试验应使用清洁级以上动物，并在屏障环境内进行试验

66GLP动物实验平台672、染毒途径亚慢性毒性试验接触外源化学物途径的选择，应考虑两点：

1.尽量模拟人类在环境中接触该化合物的途径或方式

2.应与预期进行慢性毒性试验的接触途径相一致具体接触途径主要有经口、经呼吸道和经皮肤三种68亚慢性试验的上限剂量，需控制在实验动物接触受试化合物的整个过程中，不发生死亡或仅有个别动物死亡，但有明显的中毒效应，或靶器官出现典型的损伤。此剂量的确定可参考两个数值，一是以急性毒性的阈剂量为亚慢性试验的最高剂量；二是以此化合物LD50的1/201/5为最高剂量。3.剂量选择与分组694.观察指标

（1）一般性指标1）外观体征、行为活动：（时间顺序）2）动物体重：体重变化的表示方式，可将接触组与对照组同期体重绝对增长的重量或体重百分增长率(以接触化学物开始时动物体重为100%)进行统计和比较703）食物利用率：是指动物每食入100g饲料所增长的体重克数。分析比较接触组与对照组食物利用率，有助于分析受试化学物对实验动物的生物学效应4）症状实验动物在接触外来化合物过程中所出现的中毒症状及出现各症状的先后次序、时间均应记录和分析71血液学指标：包括红细胞计数、白细胞计数和分类、血红蛋白定量、血小板等血液生化指标：AST、ALT、ALP（碱性磷酸酶）、BUN、TP、ALB、GLU、T-BIL（胆红素）、Crea、T-CHO一般为筛检性和探讨性（2）实验室检查：72亚慢毒性试验中应重视病理学检查。凡是在染毒过程中死亡的动物均应及时解剖，肉眼检查后再进行病理组织学检查。必要时作组织化学或电镜镜检

(3)系统尸检和病理学检查731）脏器系数(称脏/体比值)：是指某个脏器的湿重与单位体重的比值，通常以100g体重计。如肝/体比即(全肝湿重/体重)100此指标的意义是实验动物在不同年龄期，其各脏器与体重之间重量比值有一定规律若受试化学物使某个脏器受到损害，则此比值就会发生改变，可以增大或缩小，如增生、充血、水肿、萎缩等变化。74因此，脏/体比值是一个灵敏、有效和经济的指标2）病理学检查：组织病理学检查是亚慢性毒性试验中最重要的检测指标之一。可确定化学物对机体毒作用的靶部位、损害的性质和程度。

（4）其它检查：生物标志物75三、慢性毒性作用（chronictoxicity)慢性毒性：是指实验动物或人长期（甚至终生）反复接触外源化学物所产生的毒性效应76慢性毒性试验的试验期限，应依受试物的具体要求和实验动物的物种而定如用大鼠试验期限可为1年，用狗则试验期限可1～2年慢性毒性试验应终生接触受试物如果慢性毒性试验与致癌试验结合进行，则实验动物染毒时间最好接近或等于动物的预期寿命77（三）慢性毒性试验方法要点

1、实验动物的选择慢性毒性试验选择实验动物的条件与亚慢性毒性试验相同。但实验动物最好为纯系甚至同窝动物均匀分布于各剂量组78实验动物年龄应较小，大鼠和小鼠应为初断奶者，即小鼠出生后3周，体重1012g；大鼠出生后34周，体重50