FCM的原理及应用

流式细胞术

---原理及应用什么是流式细胞术？流式细胞仪由哪些结构组成？各个系统的工作原理是什么？流式细胞仪能做些什么？1.1流式细胞术简介流式细胞术（FlowCytometry，FCM）：是以流式细胞仪为检测手段的一项能快速、精确的对单个细胞(或生物学颗粒)的理化特性进行多参数定量分析和分选的技术。在流动的状态中检测细胞或颗粒的各项特性。检测参数：多参数；检测速度：高速，最高达上万个细胞/秒；检测结果：精度高、准确性好；检测对象：单细胞悬液或生物颗粒检测特点：单细胞水平分析可对目标细胞进行分选

流式：单个细胞分析，收集每个细胞的数据，更精准；WB：群体分析，得到多个细胞的平均值。1.2流式细胞仪的结构组成液流系统流动室液流驱动系统光学系统激发光源光束收集系统电子系统光电转换器数据处理系统细胞分选系统喷嘴电偏转板样本收集器液流驱动系统液流系统鞘流技术：根据层流原理发展起来的技术，可以实现两种液体的同轴流动，样本细胞流位于轴心稳定流动，外面包裹有鞘液(sheath)。流体动力学聚焦：稳定的液流从截面积较大的部分流入截面积较小的部分后，有一个聚焦收缩作用，细胞流直径被约束在10-20um，避免了多个细胞重叠进入检测区。鞘液的作用：1.约束样品位于喷嘴中心，提高测量精度；2.防止样品靠近喷孔壁，避免堵塞喷空；3.鞘液与细胞流同轴流动防止细胞流发生湍流。鞘液鞘液细胞流激光照射点流体动力学聚焦示意图进样速率控制通过改变样本压力可以调节样本的进样速率，而这并不是提高样本流的流速，而是改变了细胞之间的距离。高速时样本流变宽，单位时间内流经激光照射区的细胞数就增加，这样会导致变异系数增加。光收集系统滤光片的组成长通滤片(LP)：只允许特定波长以上的光束通过；短通滤片(SP)：只允许特定波长以下的光束通过；带通滤片(BP)：只允许一定波长范围内的光束通过。Long

passShortpassBandpass460500540SP500LP500BP500/50460500540460500540流式细胞仪信号检测系统透射光路FACSCantoII双激光六色电子系统光电检测器将光信号转换成电子信号。前置放大电路将信号等比例放大，输出电脉冲信号。模数转换器将模拟的电脉冲信号转换成数字信号。数据处理系统计算机系统数据采集、分析。（一）光电检测器(photodetector)光电二极管(photodiode)光灵敏度低，测定强信号（FSC）；光电倍增管(photomultiplier,PMT)光灵敏度高，测定弱信号（SSC,FL1,FL2,FL3,FL4)。PMT前向散射光光电二极管（二）电信号两种放大方式由于光信号比较弱，需将其等比例放大，方便计算机分析处理，一般信号的放大可以使用线性或对数两种方式。

线性(linear;lin)对数(logarithmic;log)一般FSC和SSC变异范围较小，故使用线性放大；荧光信号变异范围较大，多使用对数放大。1.3流式细胞术光信号检测光信号的类型散射光信号：与标记荧光素无关，是细胞的固有参数。前向散射光(forwardscatter,FSC);侧向散射光(sidescatter,SSC).荧光信号自发荧光：微弱特异荧光：标记的荧光素分子发出

的荧光，比自发荧光强很多倍。散射光信号（一）前向散射光FSC

FSC信号方向与激光束平行，偏离度一般在1-6度范围内，亦称小角度散射光，主要反映被测细胞的体积大小和活力。（二）侧向散射光SSCSSC方向与激光束和液流形成的平面相垂直，亦称90度散射光，其信号强度反映细胞内部颗粒度和精细结构的变化。（三）散射光的作用实验中，常利用FSC和SSC这两种参数的组合，区分不同的细胞群体，去除碎片、死细胞和粘连细胞的干扰。粒细胞单核细胞淋巴细胞红细胞、死细胞和碎片阈值Threshold阈值：溶液中的杂质或者死细胞，很容易产生微小的干扰信号，所以必须设置阈值，排除杂质、细胞碎片或体积较小的死细胞。FSC反映细胞体积的大小，FCM应用时常选取FSC设定阈值。5%32%默认阈值升高阈值后

荧光信号（一）荧光：

物质中的电子吸收光的能量由低能状态转变为高能状态，再回到低能状态时释放出的光。发射波长(荧光波长)Emissionwavelength激发波长Excitationwavelength＜（二）常用荧光素<499nm蓝色荧光（Blue）；

500-549nm，绿色荧光（Green）；550-584nm，黄色荧光（Yellow）；

585-615nm，橙色荧光（Orange）；616-700nm，红色荧光（Red）；

≥700nm，远红外荧光（Far-Red）。标记抗体的荧光素荧光素分子激发光波长（nm）发射光波长（nm）中文名FITC490520异硫氰酸荧光素PE488575藻红蛋白PerCP490675多甲藻叶绿素蛋白APC650660别藻青蛋白PE-Cy5496/546670藻红蛋白-花青素5PE-Cy7496/546767藻红蛋白-花青素7Alexa

Flour488495519AlexaFlour647650665核酸荧光染料PI（碘化丙啶535,623）可选择性的插入核酸双螺旋碱基对中。常用于DNA分析，需要用RNase处理细胞排除RNA对DNA荧光定量的影响；PI不能透过活细胞膜，常用于鉴定死细胞。7-AAD（7-氨基放线菌素D545,647）以插入的方式与DNA链的G-C碱基对结合，不能透过活细胞膜，常用于鉴定死细胞。DAPI（4,4,6-二脒基二苯基吲哚358,456）可以非嵌入方式与DNA链上的A-T碱基对特异性结合。变异系数明显小于其他染料，一种理想的DNA定量染料。Hoechst（343,450）常见为Hoechst33342和Hoechst33258，非嵌入的方式与DNA链上的A-T碱基对结合。能对活细胞染色，用于活细胞DNA定量分析，如精子分选；还用于侧群细胞的分选。PY（派若宁560,573）RNA染料，能进入活细胞。AO（吖啶橙509,525）DNA、RNA染料，染色后DNA呈黄绿色荧光，RNA呈橙黄色荧光，可进行DNA/RNA双参数分析。细胞周期(CellCycle)

原理：细胞在有丝分裂的过程中，核内的DNA会进行复制，造成DNA含量的变化。如果把处于G0/G1期的细胞的DNA含量看做2N的话，处于G2/M期的细胞的DNA含量则为4N。荧光染料碘化丙锭（PropidiumIodide，PI）是一种核酸特异性染料，染料的荧光强度与结合的DNA数量成正比。根据PI的这种特性，我们常常用它来揭示细胞内DNA倍性的关系，从而推导出细胞群体的周期分布。细胞凋亡(Apoptosis)

原理：细胞程序性死亡/细胞凋亡（apoptosis）是机体移除不需要的细胞的一种常见的机制。细胞凋亡早期的标志事件之一是磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine，PS）从胞膜内表面到外表面的转移。AnnexinV（AV）和PS有很强的亲和力，所以被荧光标记后常常在流式中被用来检测外翻的PS。在细胞凋亡后期，细胞膜与核膜常常会破裂。这种现象在流式中可以用PropidiumIodide（PI）检测。PI是一种核酸特异性染料。当细胞膜完整时，PI无法穿透胞膜，故无法对细胞核进行染色。AV与PI共同使用时，可以对细胞凋亡的各个时期进行检测：正常活细胞显示AV和PI的双阴性；早凋细胞显示AV阳性和PI阴性；晚凋细胞则显示AV和PI的双阳性。然而，可以被AV和PI共同染色的细胞并不一定处于凋亡晚期。坏死的细胞在晚期也会被AV和PI共同染色。所以要想做到对细胞凋亡精确的检测则需要对整个凋亡过程进行监测，即AV阴性&PI阴性→AV阳性&PI阴性→AV阳性&PI阳性。

FCM可检测下列细胞成分：表面标记物胞浆标记物核内标记物可溶性成分免疫荧光染色黏附因子表面受体细胞因子分泌到胞外的细胞因子胞内抗原核酸含量核内抗原免疫荧光染色主要包括直接和间接免疫荧光染色两种方法。间接标记的方法难以进行多色标记，而且操作复杂、信噪比高，所以一般首先直标荧光抗体。荧光抗体荧光二抗第一抗体直接标记间接标记荧光抗体的选择本实验室的FACSCantoII配置两根激光器激发六色荧光。第一激光器：488nm蓝色固态激光器激发四色。第二激光器：633nm红色氦氖激光器激发二色。荧光滤片：488nm激光：530/30nm、585/42nm、695/40nm、780/60nm633nm激光：660/20nm、780/60nm总共可以检测6色荧光可选择的荧光如下：B根据抗原表达强弱合理选择抗体不同的荧光素强度有所不同；高表达的抗原可用不太“亮”的染料，更“亮”的荧光素分配给表达低的抗原：CD4-FITC、CD25-APC、Foxp3-PEC选择荧光波谱间光谱