第二章经典技术

第二章微生物学经典技术课程标准本章要点第一节显微技术第二节无菌技术第三节分离技术第四节培养技术返回总目录1第二章微生物学经典技术ClassicalTechniqueofMicrobiology课程标准了解微生物学显微技术、无菌技术、分离技术、培养技术等四大经典技术的发展历程，掌握四大经典技术所涉及的方法。2一.显微技术(MicroscopicalTechnique)二.无菌技术(Aseptictechnique)三.分离技术(SeparateTechnique)四.培养技术(CultureTechnique)本章要点3微生物最根本的特殊性就是它们微小特殊的观察工具避免非目标菌的干扰从混杂的微生态群中区分开来特殊的培养技术显微技术无菌技术分离技术培养技术4第一节显微技术Microscopicaltechnique1显微镜技术的发展2光学显微镜样品的染色方法(Dyeingmethods

)3电子显微镜样品的制备OpticalMicroscope,OMElectronMicroscope,EM5工具是人类器官的延伸。要观察肉眼看不到的微生物，没有适当工具是不可能的。在列文虎克用显微镜揭示微小的生命世界之前80多年，已经有人制造出显微镜，并描绘了显微镜下细菌的形态。不过，看到细菌、原生动物等活的微生物，并把它们的运动记录下来的第一人是列文虎克（AnthonyVanLeeuwenhoek)。1显微镜技术的发展DevelopmentofMicroscopetechnique6随着工业发展和技术进步，显微镜经过300多年的改进，现在已经是林林总总，形式多样了。但从功能上说，无非是从器具和观察对象两方面着手提高放大倍数和增加分辨细微结构的能力。器具观察对象提高放大倍数增加分辨细微结构的能力器具观察对象波束的性质操纵装置如何突显待观察的部分电磁波光波光学显微镜电子显微镜染色7光波只能对大于其波长的物体造象可见光的波长大约是0.4—0.8微米，所以光学显微镜不可能分辨小于200纳米（0.2微米）的物体。D=0.5λ/NA8910目前的光学显微镜放大和分辨效率已经越来越接近其极限，大约可以将对象放大2000倍。由于一般细菌的直径大约是1微米，所以在光学显微镜下，只能观察细菌的一般形态和主要的细胞结构，即使较大的细菌，也不能有效地研究它们的内部细微结构。11不仅可以看到细胞中许多细微结构，还能观察分子的形态。电磁波的波长约是0.005纳米，是可见光波长的十万分之一电子显微镜的放大倍数目前可以达到百万，可以分辨0.1—0.5纳米，也就是说，物体中相距0.1—0.5纳米的两个点也可以分辨清楚。121314激光技术和计算机技术的发展显微镜的不断革新15后来发现细胞可以用染料染色，而且不同的细胞结构对染料有特异性反应，甚至不同种类微生物对同种染料的着色情况也不同。2染色方法DyeingMethods

为了提高观察效果，被观察的对象也要进行处理。开始，微生物学家在用光学显微镜观察细菌的时候，由于悬浮在液体中的细胞既微小又透明，观察起来非常困难。16染色方法的种类简单染色法（Simplestaining)复合染色法（复染法）(complexstaining)用两种或两种以上的染料对菌体或菌体的不同结构进行染色用一种染料对菌体进行染色最著名的例子是丹麦科学家革兰（Chriatian,Gram）在1884年发明的一项重要的观察细菌的方法-革兰氏染色法17这种目前仍然广泛使用的革兰氏染色反应对于细菌的鉴定具有很高的价值，而且后来发现根据这个染色反应区分的革兰氏阳性细菌（能够保留染料，故细菌呈紫色）和革兰氏阴性细菌（不能保留染料而被番红花红染成红色）在许多生理特性上有区别，例如革兰氏阳性细菌对青霉素和磺胺类药物特别敏感。现在知道这是因为两类细菌的细胞壁有很大的差异。这个方法是把细菌涂在载玻片（slide)上，在酒精灯上烘干，用结晶紫染色，再用碘液处理，然后用酒精浸洗，看细胞是否能保留染料。结果发现有些细菌能保持紫色，另一些却褪色.18正染色法(Positivestaining)负染色法(Negativestaining)对菌体或菌体内的结构进行染色对背景进行染色，而菌体无色19紫色染料20嗜酸染色法（Eosinophilicstaining）识别引起麻风的分支杆菌麻风分支杆菌21印度墨汁染色细菌荚膜细菌荚膜22孔雀绿染细菌芽胞芽胞23除了用各种染料染色样品以便清楚地观察微生物外，还可以用各种发荧光的物质来染色微生物样品。例如现在可以用一种荧光染料来区分革兰氏阳性和阴性细菌。24电子显微镜观察样品的方法很多，基本上可以分为透射型和扫描型两类。前者是电子流通过观察样品而形成图象；后者则是用来观察微生物的表面细节，分辨率大约在7纳米左右。3电镜样品的制备方法用电子显微镜观察的样品需要要经过认真细致的处理以至于今天出现了一门非常有用的技术科学—电子显微镜学251透射电子显微镜（TransmissionElectronMicroscope,TEM)的观察样品的主要制备方法：投影法在真空条件下，用电子散射能力强的重金属原子来喷镀样品表面，这样在样品和没有喷镀的区域形成了较强的反差，而没有喷镀的部分成了样品的投影，根据投影我们可以了解样品的立体形状、高度，通常用这种方法来观察细菌的鞭毛或病毒的颗粒。2627负染法。将样品的背景染色以突显样品，所以称为负染。一般是用电子密度高，本身不会显示任何结构，又和样品不起反应的物质，例如磷钨酸的钠盐将样品包围，同时染色剂还会投入观察对象的内部，这样，既能显示外形，又可在一定程度上反应样品的内部结构。用这种方法可以观察细菌细胞、病毒等。28超薄切片法

这是最常用的方法，因为可以观察细胞或其它样品内部的细微结构。通常是要按照一定程序对样品进行固定，脱水，然后包埋在树脂中作为支持物，用超薄切片机切成极薄的切片。因为只有在20—100纳米厚度的切片用投射电子显微镜才能观察，所以一般细菌样品，一个细胞要分割成10片到50片。294、冰冻蚀刻法所谓冰冻蚀刻，是把样品放在-196℃的液态氮中迅速冷冻，然后加温到-100℃，使样品变得非常脆弱易碎，再用预先也冷却到-196℃的非常锋利的玻璃断口切割经冷冻的样品，这样使样品在最容易断裂的部位断开（如果是微生物细胞，则多半是沿内膜中部），然后让样品放在真空条件下升华掉断口处的冰，最后用重金属喷镀该断口表面，即可用电子显微镜观察其结构。用这种制备方法的优点是可以避免在固定、脱水和包埋过程中造成细胞结构的人为改变而形成的假象。30312扫描电子显微镜(ScanElectronMicroscope,SEM)扫描电子显微镜是用聚焦得很细的电子束在样品表面扫描,电子激发样品表面的原子放电，释放出微细的电子簇（二次电子），用灵敏的检测装置可以捕获它们，然后通过类似电视机的原理将样品图象呈现出来。二次电子对检测器的作用取决于样品表面的性质，当电子激发样品表面突起部位时，会有大量二次电子进入检测器，而表面凹陷处则只有少量二次电子进入，所以可以显出反差突出、明暗清晰的三维图象。而且它的成像焦深较长，图象的立体感强，和肉眼所见差别不大。制备扫描电子显微镜的样品也先要经过固定、脱水等处理，以免在真空条件下变形失真，为了获得较多的二次电子，表面要喷涂重金属和碳原子。3233显微镜的问世使人类开始认识微生物，然而在对微生物的生命活动和功能有所知晓之前，微生物学并没有诞生。促使微生物学迅速诞生的，是无菌操作技术、分离技术和纯培养技术。第二节无菌技术(Aseptictechnique)1无菌技术建立的历史背景34微生物是从哪里来的？在列文虎克发现微生物后，这些成了当时人们关心的问题。有些人认为是从没有生命的物质“自然发生”的，这就是古已有之的观点，叫做自然发生论(abiogenesis,autogenesis,spontaneousgeneration)。自然发生论者认为破布中会自然产生老鼠，污泥中会生出泥鳅，我国古代也有“腐草化为萤”的说法。35意大利科学家斯巴兰让尼马上就指出他的实验有许多漏洞，并且证明任何一种肉汤或菜汁，在充分煮沸并且密封后，只要里面没有活的微生物，就不会腐败。一顽固的自然发生论的信徒出来辩解，他们说斯巴兰让尼在把液体煮沸并密封后，因为也把氧气赶走和隔绝了，所以微生物缺少营养而不能生长，并不是消灭了微生物本身。1749年，英国神父尼德汉发表文章，证明微生物可以自然发生。18世纪末发现了氧气，大家公认没有氧气生物就不能生活36巴斯德这个简单但是具有说服力的著名实验，证实了微生物只能从微生物产生而不能自然地从没有生命的物质发生。而这个科学论断的确立，为研究微生物奠定了基础。在1861年，伟大的微生物学家巴斯德做了一个有名的实验—鹅颈瓶实验，从此结束了绵延100多年的争论，把自然发生论赶出了科学界。37人们可以把不同的微生物从天然的混杂状态下放在较少受其它微生物影响的条件下来研究。同时，无菌技术对于物资的保护、疾病的防治，也是非常重要的。现在，我们只要在操作中排除外来的微生物进入我们的容器，就可以保证其中没有生命我们在严格排除其它微生物混入的操作条件下把待研究的微生物放到事先杀死了全部生物的容器中，则其中只有我们要研究或观察的对象，非此莫属。人们开始认识到无菌操作的重要。灭过菌的物质在适当保护下将保持无菌状态，除非有人去感染它。巴斯德奠定了这个微生物学的基本原理。38巴斯德是第一个自觉地通过无菌技术实现食物保鲜和防治疾病的人，因为他从理论上解决了微生物不能自然发生的争论。而英国外科医生李斯特用石炭酸消毒方法的开创，更是无菌技术给人类带来的巨大实惠。无菌技术的使用远在微生物学出现之前，例如用火烧或煮沸的方法保持食品卫生或消灭病原的做法至少可以在几千年前的文字中见到。近代有意识利用无菌技术的，是法国的厨师兼糖果制造商人尼可莱.阿佩尔（Nicolas,Appert），他发明了罐头技术。阿佩尔花了14年的时间，完成了拿破仑悬赏征求的食品储存方法。这种方法是把食品先加热，然后把它密封起来与空气隔绝。1809年拿破仑奖励了阿佩尔1万2千法郎，阿佩尔公开了他的发明。这项重要发明当时还不能完全说清道理，直到巴斯德证实了微生物只能从微生物产生而不能自然地从没有生命的物质发生以后才为大家所理解和应用。39采用无菌技术所达到的程度，可以是不同的。一般分为灭菌、消毒和防腐3个不同层次。灭菌Sterilization

消毒Disinfection防腐Anticorrosion化疗Chemotherapy2消毒或灭菌的方法用物理或化学的方法杀灭物体内外所有微生物用物理或化学的方法杀灭物体内外所有病原微生物用物理或化学的方法抑制物体表面或内部微生物的生长采用化学治疗剂杀灭或抑制动物体内微生物40在微生物学研究、微生物工业生产和大型手术中，为了获得可靠的结果、保证生产的顺利或避免感染，要求将器具、场地、环境进行灭菌；而对于一般的食品，为了保证其营养成分不受或少受破坏，所以通常只须采取消毒和防腐措施。我们通常在得了炎症时服用抗生素或磺胺类药物抑制体内的致病菌，也可以认为是无菌技术的应用。在培养某些需要生长较长时间的微生物或组织时，通常要加入抑制细菌生长的抗生素。41实现消毒或灭菌的方法很多，基本上可以分为物理学方法和化学方法两大类。物理学方法主要包括加热、低温、过滤和电离辐射等。42加热灭菌Heatingsterilization

加热可以引起生命物质如蛋白质、核酸和脂类的破坏，从而导致其死亡。目前使用的有两大类，即干热灭菌和湿热灭菌。干热灭菌最常用的是火焰灼烧灭菌。这是最彻底的灭菌方法，但是并不是随时随处可以应用的。我们常常用这种方法来处理病死的家畜家禽、实验室或发酵车间用于接种的工具灭菌。在要求灭菌后的器具干燥的情况下，通常也采用干热空气灭菌。例如用电热干燥箱在160℃～180℃保持1～2h，可以将玻璃或金属器皿完全灭菌。43湿热灭菌的方法更多。因为在有水或水蒸汽存在的条件下，细胞内部更易遭受伤害，所以可以在较低的温度和较短的时间内达到灭菌的目的。微生物的营养细胞比较容易被杀死，而芽胞则较耐热。44目前采用的湿热灭菌方法有：1）常压法巴斯德消毒法煮沸消毒法间歇灭菌法低温维持法和高温瞬时法两种，前者是在63℃维持30分钟，后者则是在72℃处理15秒在常压下通过煮沸来达到消毒目的。例如在非高原地区将水加热到100℃来消毒饮用水。又叫分段灭菌法，方法是：将要灭菌的液体在90-100℃加热15分钟以上，使营养细胞死亡，然后将其冷却到30℃，并保持这个温度过夜，这时，灭菌样品中没有被杀死的芽孢因为温度适合而萌发成营养细胞，到第二天再把该液体在90-100℃加热15分钟以上。如此重复3～4次，即可以将液体中的微生物全部杀死，达到灭菌的目的。某些做微生物学实验的培养基，因为某些成分在120℃左右容易破坏，就可以采用间歇灭菌法。452）加压法又称高压蒸汽灭菌法，因为在超过大气压的密闭容器中，水蒸汽的温度可以大于100℃，更有利于杀死微生物。灭菌条件通常为121℃灭菌15-30min46低温法抑菌冷冻和加热的不同之处是这种方法不是简单地破坏微生物，而是抑制微生物的生长和繁殖。低温法抑菌在食品工业中采用最多，因为在低温下（4℃左右）大多数病原菌都不能生长，在微生物学实验和微生物工业中，这种方法不能起到灭菌的作用。一般在-20℃微生物就不会生长了，因为此时没有液态的水供微生物活动之用，也有些微生物可以被冰杀死，因为冰会破坏微生物细胞膜。低温抑菌法可以用来保藏菌种、保藏食物等47过滤法除菌有些需要灭菌的材料不能受热，例如许多维生素溶液。因此，许多液体可以用过滤法来灭菌。过滤法不是将微生物杀死，而是把它们排除出去。目前过滤除菌采用两类器具，一类叫深层滤器，例如用烧结玻璃、不上釉的陶瓷颗粒或石棉压成的滤板等：另一类是滤膜。深层滤器已经使用了100年以上，现在有逐渐被滤膜取代的趋势，但因为大量沉淀物容易堵塞滤膜，所以一般先用深层滤器除去大的颗粒。滤膜一般由醋酸纤维素、硝酸纤维素、多聚碳酸酯、聚偏氟乙烯等合成纤维材料制成。滤膜的孔径一般为0.2微米，它可以滤除绝大多数微生物的营养细胞。过滤法的最大缺点是不能滤除病毒48如图所示，在一个漏斗形容器上部放置数片滤膜。右图是整个过滤系统。待除菌的液体装在三角瓶中（1），用蠕动泵（2）将液体抽到过滤器（3）内，滤过的液体进入事先灭菌的瓶子中。12349过滤法用途广泛，除在饮料、药物生产中使用外，空气也常常用过滤法除菌。我们通常做微生物学实验时灭过菌的容器一般用棉花塞堵在出口处，实际上就是过滤除去空气中的微生物，使进入容器的空气中没有微生物污染。微生物学实验室使用的超净台也是用过滤法除菌。50辐射灭菌辐射灭菌是利用电磁辐射产生的电磁波杀死大多数物质上的微生物的一种有效方法。用于灭菌的电磁波有微波、紫外线（UV）、X射线和γ射线等。它们都能通过特定的方式控制微生物生长或杀死微生物。微波可以通过热产生杀死微生物的作用紫外线使DNA分子中相邻的嘧啶形成嘧啶二聚体，抑制DNA复制与转录等功能，杀死微生物X射线和γ射线能使其它物质氧化或产生自由基（OH·H）再作用于生物分子，或者直接作用于生物分子，打断氢键、使双键氧化、破坏环状结构或使某些分子聚合等方式，破坏和改变生物大分子的结构，从而抑制或杀死微生物。可见光在长时间照射后，也能损害微生物或杀死它们，因为所有光合生物含有叶绿素（或细菌叶绿素）、细胞色素、黄素蛋白等光敏感色素，它吸收光能变成激发态或被活化，并将吸收的能量转移到氧，产生氧自由基作用于细胞，导致机体突变或死亡。51实行辐射灭菌的装置包括微波炉、紫外光灯、阴极射线管、X射线发生器、放射性核素等。商业上用于大量物品灭菌使用的放射性源是钴-60和铯-137，它们发射出γ射线，相对而言比较廉价。辐射灭菌用途很广，例如医疗器械和用具（如注射器灯）、食品、实验室的许多塑料制品和多种培养基都是用这种方法灭菌。52化学灭菌用于抑制微生物生长或杀死微生物的化学药品很多，我们可以通称为化学灭菌剂。在微生物学实验研究和保藏物资或食品上化学灭菌方法也有重要用途。5354553保持无菌状态Maintainsterileconditions

另外，我们还要防止所研究的微生物，特别是致病微生物或经过基因工程改造了的本来自然界不存在的微生物从我们的实验容器中逃逸到外界环境中去。为了这些目的，在微生物学中，有许多措施。在获得了无菌环境和无菌材料后，我们还要保持无菌状态，才能对某种特定的已知微生物进行研究或利用，否则外界的各种微生物很容易混入。外界不相干的微生物混入的现象，在微生物学中我们叫做污染杂菌。防止污染是微生物学工作中十分关键的技术。一方面是彻底灭菌，另一方面防止污染，是无菌技术的两个方面。56无菌室外要设一个缓冲间，缓冲间的门和无菌室的门不要朝向同一方向，以免气流带进杂菌。门多用推拉式，便于快速启闭。无菌室和缓冲间都必须密闭。室内装备的换气设备必须有空气过滤装置。无菌室内的地面、墙壁必须平整，不易藏污纳垢，便于清洗。工作台的台面应该处于水平状态。无菌室和缓冲间都装有紫外线灯，无菌室的紫外线灯距离工作台面1米。工作人员进入无菌室应穿灭过菌的服装，戴帽子。无菌室Sterileroom

一般是在微生物实验室内专辟一个小房间。可以用板材和玻璃建造。面积不宜过大，约4—5平方米即可，高2.5米左右。57无菌室平面图58通过电动装置使空气通过高效过滤器具后进入工作台面，使台面始终保持在流动无菌空气控制之下。而且在接近外部的一方有一道高速流动的气帘防止外部带菌空气进入。超净台是20世纪80年代开始问世的一种防止污染的装置。其主要功能是利用空气层流装置排除工作台面上部包括微生物在内的各种微小尘埃。5960结构简单，便于移动，箱正面开有两个洞，不操作时用推拉式小门挡住，操作时可以将双臂伸进去。正面上部装有玻璃，便于在内部操作，箱内部装有紫外线灯，从侧面小门可以放进去器具和菌种等。无菌箱611纯种分离技术的发展过程2纯种分离的主要方法第三节分离技术SeparateTechnique62在自然界中，各种微生物之间并不是离群索居，彼此老死不相往来的。在任何天然环境中，都有多种微生物共同生活。要了解某种微生物对于人类有害还是有益，或者目前与人类还没有什么特别密切的关系，就必须单独把这种微生物分离出来研究。这就是在无菌技术的基础上微生物学的另一项基本技术——纯种分离技术。1纯种分离技术的发展过程63要从含有成亿个细胞，成百个种类微生物的样品中分离出某种微生物，并不是容易的事。第一个成功地分离出纯种细菌的，是前面提到过的在手术中采用消毒剂的医生李斯特。关键在于他发明了一种可以取出数量可以小到0.00062毫升牛奶的微量注射器。64李斯特用不含任何微生物的灭过菌的水稀释极少量的牛奶，再把稀释的牛奶分装在几个灭过菌的酒杯中，成功地分离出制造酸奶用的乳酸链球菌（Streptococcuslactis）。这种方法经过100多年的改进，现在仍然是一种分离纯种微生物的常用方法，叫做系列稀释法，也叫倍减稀释法（Ten-FoldDilutedMethod

）。65十倍递减稀释法（Ten-FoldDilutedMethod)66真正解决问题的纯种分离方法，是著名的德国医生，伟大的微生物学奠基人之一科赫和他的研究小组建立起来的。科赫在明胶中加上一些营养物质（例如肉质）加热融化后倒在一片灭过菌的玻璃片上，待其凝固用在火焰上烧红过、因而烧死了全部原来附着的微生物的白金丝蘸上一点要分离的样品在凝固的明胶上轻轻划动，使样品中的很少量微生物沾在明胶上，然后用玻璃罩盖上玻璃片，以防空气中的杂菌落下污染。几天后，明胶板上便长出一个个彼此分开的菌落由于明胶是透明的，所以很容易观察因为白金丝烧红后很快便会冷却，立即用来蘸样品时也不会烧死样品中我们需要分离的微生物。现在我们用电炉丝代替，价格便宜多了，这就是我们今天常见的接种针和接种环这种方法叫划线分离法67平板划线分离法（StreakPlateMethod）6869另一位助手Petri又设计了一种圆形的有边的，可以对着盖起来的培养器具，使得融化的洋菜或明胶不会随便乱流，又可以避免污染杂菌，这就是每个微生物学工作者都非常熟悉的培养皿（PetriPlate）。但是，明胶在摄氏20多度会融化，在一般细菌生长需要的37℃下不能成为固体，菌落便不可能形成。科赫的助手Heese在他妻子的提示下，发现用洋菜（学名叫琼脂agar，一种做果酱的植物胶）代替明胶，可以克服明胶在37℃会融化的缺点70柯赫（RobertKoch）的助手WHeese和他的夫人FranHeese71为了排除这个疑点，当时人们采用反复多次，并仔细用显微镜检查的办法。后来，有人发明了可以在显微镜下用极细的玻璃丝挑取单个细胞的工具——单细胞分离器，纯种分离的技术便成熟了。我们也许会提出一个疑点：在马铃薯片或琼脂上长出的菌落真是由一个微生物细胞繁殖来的吗？可能不是!长期实践的经验告诉我们，尽管不用单细胞分离器有一定风险，但是用稀释法或划线分离法，在适当重复操作后，在很大程度上可以达到纯种分离的目的。72为了获得单一类型微生物，即纯培养物Pureculture，微生物学家通常采用称作富集培养的技术。所谓富集，就是指在分离纯培养之前，通过这种技术使需要分离的对象在培养基中尽量生长得多一点。为了富集，首先要选择好适合对象微生物的培养基，微生物学家称为选择性培养基(Selectivemedium)。73根据这个原理，我们如果想得到具有某种特定功能的微生物，首先可以用选择培养基来进行富集。如果我们想得到能够分解橡胶或塑料的微生物，就可以在培养基中加进橡胶或塑料。虽然我们在自然界中可以见到一些对简单的富集技术无动于衷的微生物，但一般说来，富集培养是寻求微生物纯培养的第一步。74一个简单的例子是引起伤寒的伤寒杆菌，当刚从伤寒病患者体内分离出来时，常常需要向培养基中补加一种氨基酸促进它们生长，但在实验室中培养几次后，它们容易丧失此种特性，即变得能够自己制造这种氨基酸了，当用该菌株去感染实验动物并再度分离它时，它又恢复了需要氨基酸的这一特性。我们在实验室中分离纯化的微生物是否与自然界实际存在的完全一致呢？这是个问题?!已故的荷兰卓越微生物学家克鲁维教授早就指出，所有的细菌培养物均是实验室的人工产物，为了适应实验室的生长条件，这些微生物的特性已经起了变化。我们必须牢记，不要把实验室中微生物材料的表现完全等同它们在自然环境中的情况。752纯种分离的主要方法用固体培养基分离纯培养用液体培养基分离纯培养单细胞（孢子）分离法选择培养分离法76用固体培养基分离纯培养1、稀释倒平板法(PourPlateMethod2、涂布平板法(SpreadPlateMethod)操作较麻烦，对好氧菌、热敏感菌效果不好！使用较多的常规方法，但有时涂布不均匀！77用固体培养基分离纯培养3、平板划线法78用固体培养基分离纯培养3、平板划线法79用固体培养基分离纯培养4、厌氧微生物的分离厌氧罐厌氧手套箱80用固体培养基分离纯培养4、厌氧微生物的分离厌氧罐厌氧手套箱81用固体培养基分离纯培养4、厌氧微生物的分离稀释摇管法82用液体培养基分离纯培养0.0480.048+0.0012+0.0002=0.975稀释法进行液体分离必须在同一个稀释度的许多平行试管中，大多数（一般应超过95%）表现为不生长。例如：若同一稀释度的试管中有95%表现为不生长，则生长的试管中仅含一个细胞的几率为：4.8%；含二个细胞的几率为：0.12%；含三个细胞的几率为：0.002%在有细菌生长的试管中得到纯培养的几率为97.5%831878年，Lister分离乳酸链球菌时所使用的微量注射器和酒杯培养装置注射器的最小吸取量：0.00062毫升8485单细胞（孢子）分离一般采用显微操作仪，在显微镜下进行；操作难度与细胞或个体的大小成反比；86选择培养分离法抑制大多数其它微生物的生长；使待分离的微生物生长更快；使待分离的微生物在群落中的数量上升，方便用稀释法对其进行纯化。微生物群落中数量占少数的微生物的分离纯化：（没有一种培养基或一种培养条件能够满足自然界中一切生物生长的要求，在一定程度上所有的培养基都是选择性的。）使待分离的微生物生长“突出”；直接挑取待分离的微生物的菌落获得纯培养。87选择培养分离1.利用选择平板进行直接分离待分离的微生物生长，其它微生物的生长被抑制高温下培养：分离嗜热细菌；培养基中不含N：分离固氮菌；培养基加抗生素：分离抗性菌；88选择培养分离1.利用选择平板进行直接分离待分离的微生物的生长特征明显不同于其它微生物颜色反应：分离特定的菌株；牛奶平板：分离蛋白酶产生菌；利用特定细菌的滑动特点进行分离纯化；899091选择培养分离2.富集培养从自然界中分离到所需的特定微生物特定的环境条件仅适应于该条件的微生物旺盛生长待分离微生物在群落中的数量大大增加922.富集培养富集培养是微生物学家最强有力的技术手段之一。营养和生理条件的几乎无穷尽的组合形式可应用于从自然界选择出特定微生物的需要。根据微生物的特殊要求，从自然界分离出特定已知微生物种类；分离培养在特定环境中能生长的微生物；93无菌操作和纯种分离技术确立以后，一方面分离了一大批纯种微生物，极大地推动了传染病学和工业微生物学的发展，一方面又提出如何获得大量纯种培养物的要求。第四节培养技术CultureTechnique因为在研究病原微生物时，尤其是采用打预防针的办法防治疾病时要制备疫苗或菌苗需要有大量的微生物细胞；在工业上例如生产啤酒时也需要大量的纯种酵母菌。因此，纯种培养技术便应运而生了。94因为培养好的微生物则称作培养物(Culture)，只有一种微生物的培养物称为纯培养（PureCulture）。采用无菌操作，微生物学家们在实验室里，为微生物制备的各种适合微生物良好生长的基质，称作培养基(medium)。把纯种微生物放进培养基里让它们生长的操作，叫做接种(inoculation)。这样可以保持培养微生物的“纯一”。1培养基(medium)95如何配制某种特定微生物的最佳培养基，是微生物学中的重要课题。有些微生物目前还不能用人工配制的培养基来培养，必须采用活的生物或组织。没有一种培养基