产纤维素酶的筛选

一株产纤维素酶新菌株的筛选

及酶学性质初步研究

主讲人：何园学号：2014103015时间：2014.11.131.研究背景2.试验目的3.技术路线4.试验方法5.预期效果6.参考文献讲解内容一.研究背景纤维素作为地球上最丰富的可再生有机资源，其转化和利用对解决能源危机、粮食短缺、环境污染等问题具有十分重要的意义。纤维素酶是能够作用于纤维素底物β-1,4葡萄糖苷键的一类生物酶的总称。由于开发利用木质纤维资源对人类社会的今后发展具有重大意义，而纤维素酶对纤维素资源的开发起到极为关键的作用，对其研究一直是国内外的热点。纤维素代谢也是地球生物圈碳素循环的重要组成部分，寻找和开发高产纤维素酶菌种，是充分利用纤维素资源的关键。研究进展：

该类酶上世纪40年代首次被发现。早期发现的纤维素酶主要由丝状真菌的木霉、根霉等菌种产生，通常为酸性酶其最适作用pH值在3-5，在碱性条件下基本没有酶活或活力很低。上世纪70年代，在嗜碱性的枯草芽孢杆菌(Bacillussp.N-4和Bacillussp.1139菌株)中发现了最适作用pH在碱性范围的纤维素酶，即碱性纤维素酶。随后发现芽孢杆菌属(Bacillus)和链霉菌属(Streptomyces)的数十株嗜碱性菌株均能够产生碱性纤维素酶，此外，动物源碱性纤维素酶开始被报道，并成为开发碱性纤维素酶的重要方向。二.试验目的目前，酸性纤维素酶主要用于纤维素的水解糖化，而碱性纤维素酶则广泛用于洗涤工业。不过，至今所研发的纤维素酶仍存在酶活力不足等问题，有必要挖掘新的酶资源。三.技术路线产纤维素酶菌株的初筛产纤维素酶菌株的复筛菌株形态观察菌株分子鉴定诱变育种产高活性纤维素酶菌株的鉴定菌株生化鉴定优化产酶菌株的培养条件制备酶液测定酶活力绘制菌株生长曲线和产酶曲线图测定CMC酶的最适作用条件确定产纤维素酶菌株的属种比较两种菌株酶活力测其透明圈及酶活力四.试验方法1.材料和仪器(1).用于菌株分离的样品采自畜禽堆肥。(2).所用培养基：LB培养基、CMC-刚果红平板筛选培

养基、CMC液体发酵培养基、Bug培养基(3).仪器:菌种鉴定96孔板2.方法

(1).菌株初筛：取样品1g，加10mL无菌蒸馏水，充分振摇，静止30min，取上清液稀释105倍，涂布接种CMC-刚果红平板筛选培养基，30℃培养72h至菌落长出，挑取透明水解圈较大的菌落。(2).菌株复筛：挑取透明水解圈较大的菌落，接种CMC液体发酵培养基，37℃、200rpm摇瓶培养24h，测定培养液的碱性CMC酶活力，选取活力最高的培养瓶，取菌液划线接种CMC-刚果红平板筛选培养基培养，纯化菌种３次，最后得到产碱性纤维素酶的高产菌株，命名，斜面和冷冻干燥保藏。(3).菌株的形态观察：LB培养基培养的菌体用革兰氏染色，显微镜观察菌株形态。(4).分子鉴定：提取菌体DNA(CTAB法)，以该基因组DNA为模板，采用通用引物27F/1492R，PCR扩增菌株的16SrRNA序列。PCR产物用琼脂糖凝胶电泳检测、分离，然后用AgaroseGel

DNAPurificationKit试剂盒切胶回收，用T4ligase连接到Pmd-18T载体上。将带有目的片段的载体通过转化E.coliDH5α菌株扩增培养后，选择阳性克隆提取质粒测序。将测序得到的16SrRNA序列用NCBI的BLAST2.0进行同源分析，搜索Genebank核酸数据库，根据比对结果对菌株进行分子鉴定。(5).菌株生化鉴定:采用Biolog微生物鉴定系统进行。操作按仪器的说明书进行。(6).诱变育种：●制备孢子悬液：取试管斜面，用无菌水洗下孢子，装入带玻璃珠的三角瓶中，27℃振荡2-3h，用脱脂棉过滤后，以10倍稀释法作一系列稀释，挑选一个稀释度，用移液管移lml饱子悬液到小塑料离心管中，待用。●紫外(UV)诱变方法：距离紫外灯30cm左右照射60s、70s、80s、90s、100s，并不断摇动。●硫酸二乙酯(DES)诱变方法:分别吸取1ml孢子悬液10ulDES(终浓度为1%)和30ul乙醇溶液于一小塑料离心管中，于30℃水浴振荡45min、60min、75min，处理完毕后加入30ul25%的硫代硫酸钠溶液终止反应。●

UV-硫酸二乙酯(DES)复合诱变(7).测定诱变后菌株的透明圈并将其菌株发酵测其酶活力。(8).菌株生长及产酶特性测定:活化菌株接种CMC发酵培养基，接种量5％，30℃、200rpm下培养，定时取样测定培养液的OD600和CMC酶活力，观察菌株生长和产纤维素酶情况，绘制菌株生长曲线与产酶曲线图。优化菌株的培养条件，对3-12的pH值条件以及25-37℃温度条件下菌株生长也进行观察。(9).酶液制备:活化菌株接种CMC发酵培养基30℃、200rpm培养48h，取培养液，4℃，4000rpm离心10min，取上清，55%(NH4)2SO4溶液沉淀粗蛋白,4℃，10000rpm离心10min，收集沉淀，加入培养液同体积的pH值8.0，0.1mol/L的Tris-HCL缓冲液溶解，４℃保存，用于测定酶的活力，2d内使用。(10).酶活力测定:以CMC钠盐为底物，测定CMC酶活力。酶反应体系含粗酶液0.5mL，CMC钠盐1%(g/mL)，0.1mol/L的Tris-HCL(pH值为8.0)缓冲液2.0mL。50℃水浴反应60min，立刻用DNS法测定CMC水解所释放的葡萄糖量。以作用CMC钠盐底物1min释放1mg葡萄糖所需的酶量定义为１个酶活力单位。(11).比较诱变菌株与原菌株的酶活力。(12).绘制菌株生长曲线与产酶曲线图:以最适的pH,温度条件培养产酶菌株，每隔4h取一次发酵液，测定OD600

值与纤维素酶活力，绘制菌株生长曲线与产酶曲线图。(13).测定CMC酶的最适作用pH值，最适作用温度以及热稳定性。五.预期试验结果1.可以分离出一株产纤维素的菌株。2.鉴定出该菌株所属的属种。3.对该菌株所产的纤维素酶有一定的了解，绘制出产

酶曲线图和菌株生长曲线，用来指导发酵工业。4.用诱变后的菌株看能否提高产酶活性，以更好的生

产出纤维素酶。六.参考文献[1].禤金彩,廖龙,龙寒,etal.一株产纤维素酶蜡样芽孢杆菌

的分离鉴定及酶学性质初步研究[J].南方农业学报,2014,45(6):984-988.[2].芦志龙,张穗生,吴仁智,etal.产纤维素酶新菌株的筛选

及其产酶特性研究[J].广西科学,2014,21(1):22-27.[3].封晔,来航线,郑真.高产纤维素酶菌株的筛选及其产酶

条件研