恶性肿瘤的基因治疗

恶性肿瘤的基因治疗制作人：熊乐聂彬恩重新燃起的希望GeneTherapy

在“全国首届肿瘤并发症介入治疗学术研讨会”上，专家指出，约有80%-90%的病人死于肿瘤并发症，而非肿瘤本身。据专家介绍，肿瘤并发症是指在自然病程发展过程中，肿瘤发生侵犯、转移到某些脏器，或者是在治疗过程中因手术、放化疗而难以避免所产生的一系列综合病症。肿瘤并发症对患者的生命、生活质量均会产生不同程度的影响，严重的并发症是肿瘤患者的主要死因。专家强调，在全力针对肿瘤的治疗过程中，切不可忽视肿瘤并发症的治疗目前研究表明，肿瘤细胞逃避机体免疫攻击的可能原因包括肿瘤的抗原调变和异质性、瘤细胞的MHC抗原和共刺激分子表达不足、APC功能缺陷、局部细胞因子缺乏以及游离的免疫抑制性细胞或分子在局部浓聚等，这多种因素最终造成肿瘤局部处于深度的免疫抑制状态，免疫效应细胞在数量和质量上都不足以激发起有效的抗肿瘤免疫应答。因此，试图逆转肿瘤局部的免疫抑制状态，增强原先呈低下状态的肿瘤免疫原性，提高局部活化的免疫效应细胞的数量，以激发起强烈的抗肿瘤免疫反应，可能是机体得以排斥肿瘤的有效手段，这也是目前肿瘤免疫（生物）治疗的一个主要目的以过继免疫疗法为基础将细胞因子基因导入导入抗肿瘤的免疫效应细胞，回输体内，提高局部细胞因子的浓度，提高其抗肿瘤的活性，从而更有效的激活机体抗肿瘤免疫功能常见的有CTL(细胞毒性T淋巴细胞)、CIK(细胞因子诱导的杀伤细胞)、NK(自然杀伤细胞)、巨噬细胞、LAK(淋巴因子激活的杀伤细胞)和TIL(肿瘤浸润性淋巴细胞日本watanabe实验室将ifn-v基因转到CTL其肿瘤杀伤活性提高2-3倍，在体内抑癌效果明显优于未转基因的CTL一：细胞因子基因导录入免疫效应细胞的基因治疗以主动免疫疗法为主，肿瘤细胞转入细胞因子后，其MHC抗原分子表达能力增强，促使多种免疫细胞在肿瘤局部浸润从而增强抗肿瘤免疫二：细胞因子基因导录入肿瘤细胞的基因治疗在1993年由nabel首先应用于临床，他们将用脂质体包埋直接注射到5例HLA-B7阴性的黑色素瘤患者瘤内，患者的CTL活性明显提高，肿瘤不同程度的缩小，其中一名患者肿瘤完全消失三：导入MHC抗原基因的肿瘤基因治疗利用反义核酸技术在转录和翻译水平上阻断肿瘤细胞中异常基因的表达，从而引起细胞的表型逆转或凋亡四：导入原癌基因和生长因子的反义基因反义核酸第一类将特异的反义基因重组到表达的载体上导入到靶细胞中转录出反义RNA形成双链RNA阻断mRNA第二类是人工合成寡聚脱氧核糖核苷酸，经化学修饰导入细胞与mRNA结合，形成RNA-DNA杂链或核苷酸三聚体，影响基因的转录或翻译第三类是特异的核酶根据抑癌基因设计出特异的“锤头”或“发夹”结构，它能够催化切割或降解异常表达的mRNA阻断基因的翻译1：起始阶段，加入的小分子RNA被切割为21-23核苷酸长的小分子干扰RNA片段(smallinterferingRNAs,siRNAs)。证据表明；一个称为Dicer的酶，是RNaseIII家族中特异识别双链RNA的一员，它能以一种ATP依赖的方式逐步切割由外源导入或者由转基因，病毒感染等各种方式引入的双链RNA，切割将RNA降解为19-21bp的双链RNAs(siRNAs)，每个片段的3’端都有2个碱基突出RNAi分之生物学机制2：RNAi效应阶段，siRNA双链结合一个核酶复合物从而形成所谓RNA诱导沉默复合物（RNA-inducedsilencingcomplex,RISC）。激活RISC需要一个ATP依赖的将小分子RNA解双链的过程。激活的RISC通过碱基配对定位到同源mRNA转录本上，并在距离siRNA3’端12个碱基的位置切割mRNA。尽管切割的确切机制尚不明了，但每个RISC都包含一个siRNA和一个不同于Dicer的RNA酶。另外，还有研究证明含有启动子区的dsRNA在植物体内同样被切割成21-23nt长的片段,这种dsRNA可使内源相应的DNA序列甲基化,从而使启动子失去功能,使其下游基因沉默.RNAi在肿瘤治疗中的意义ras基因包括K-ras、H-ras、N-ras,是鸟苷酸结合蛋白,对细胞的繁殖、分化和细胞生存起调控作用。ras基因突变可使之处于长期激活GTP结合状态,易导致肿瘤的发生。K-ras基因在人类肿瘤中最普遍活化状态的致癌基因，在肿瘤组织中的突变率30-50%，在胰腺癌中高达85%。突变的Ras基因与正常细胞中的野生型ras基因通常只有一个碱基的不同，但由于RNAi的高度特异性，可以针对肿瘤细胞中突变的ras基因产生抑制作用，而对正常细胞的野生型ras不产生抑制作用。

最近Li-MoChen等报道建立K-rasV12突变基因的siRNA腺病毒表达载体,转染Panc-1胰腺癌细胞诱导凋亡、逆转肿瘤恶性表型。WeiWang等通过构建K-ras基因的siRNA表达框架(siRNAexpressioncassette,SEC)成功抑制胰腺癌细胞株MiaPaCa-2的K-ras表达。Fleming等报道，利用化学合成anti-K-ras-siRNA抑制了PANC-1和MaiPaca-2胰腺癌细胞K-ras的表达，并观测到集落形成能力、细胞增殖能力和侵袭能力降低、凋亡增加，与VEGF）和血小板反应素（thrombspondin-1，TSP-1）基因和c-myc的下游调控元件、与肿瘤转移相关的葡萄糖转运蛋白1（glucosuetransporter，GLUT-1）基因表达变化。

癌胚抗原相关细胞黏附分子6（CEARAM6）是免疫球蛋白超家族的成员，在许多肿瘤中都有表达，对肿瘤的形成、抵抗“失巢凋亡”（anoikis：正常内皮细胞或表皮细胞黏附不适宜的基质时引起细胞凋亡的一种现象）和形成转移起到重要作用。DuxburyMS等通过化学合成anti-CEARAM6-siRNA抑制失巢凋亡高抵抗性MiaPaCa-2胰腺癌细胞株的CEARAM6的表达，观察到失巢凋亡抵抗性的减弱以及肿瘤细胞在体内、外模型中转移能力的降低。他们还分别利用逆转录病毒siRNA表达载体和化学合成的方法介导了对CEARAM6基因高表达BXPC3胰腺癌细胞株CEARAM6基因的敲减,观测到肿瘤细胞侵袭能力降低、转移瘤生成能力下降，进一步证明了CEARAM6基因在肿瘤形成、转移过程中起重要作用，为肿瘤的RNAi治疗提供了作用靶点。

应用反义技术进行肿瘤基因治疗最常用的靶基因有Ha-ras、c-myc、c-fos、c-jum、c-erbB2等癌基因以及编码端粒酶基因，或端粒酶的RNA部分。

抑癌基因是抗肿瘤基因治疗中一类极为重要的目的基因，将这类基因导入肿瘤细胞或非肿瘤细胞，其表达产物通过复杂的基因调节或活化代谢机制，能抑制肿瘤的恶性生长，甚至可导致癌细胞逆转。虽然肿瘤的发生发展是一个多基因参与、多步骤形成的过程，但在这些过程中某种癌基因的激活或抑癌基因的失活可能起到了关键性的作用。五：恢复和增强抑癌基因的功能——引入抑癌基因用基因替代等方法恢复或增强抑癌基因杂合性的缺失，将某些含有抑癌基因的染色体片断或整条染色体臂导入那些已知或疑有抑癌基因缺失的肿瘤细胞或荷瘤动物体内，以消除肿瘤细胞的恶性表型和在体内致癌性，从而达到控制肿瘤细胞异常生长的目的。基因治疗和免疫的靶特异性分子治疗已进入临床研究阶段。如通过载有野生型P53的腺病毒载体进行瘤体内注射。这种用病毒载体介导的转导肿瘤抑制基因治疗方法代表了癌症治疗的策略之一。用肿瘤抑制基因如P53、Rb治疗因那些有这类基因突变的肿瘤是有价值的体外转导抑癌基因对恶性肿瘤特征的影响有：转导WT、p53能使结肠癌、骨肉瘤、神经胶质瘤、腺癌增殖降低；转导Rb基因能使视网膜母细胞瘤、骨肉瘤、前列腺癌增殖降低；转导wT-1能使裸鼠体内wilms’瘤形成下降；转导NF1能使神经纤维瘤病病灶减少；增加p16基因能使裸鼠体内神经胶质瘤形成减少。

在实体肿瘤中抑癌基因P53分子对由化疗引起的DNA损伤有重要的作用,可引起细胞周期停滞与促使细胞凋亡，在食道癌研究中已获疗效。自从1994年Okamato等构建含有p16INK4cDNA的表达载体pCMV-p16，成功地转染p16INK4基因缺失的肺癌细胞系Calu-6和卵巢癌细胞系SKOV-3，抑制了瘤细胞株的集落形成率，并使瘤细胞的继续生长得到控制。此后，在头颈部癌、卵巢癌中用腺病毒介导野生型P53去消除P53的突变，取得一定的疗效。

虽然目前世界上肿瘤基因治疗是基因治疗研究的热点，但是基因治疗作为肿瘤治疗的手段尚很不成熟。首先肿瘤的发生涉及很多基因的改变，很难想象只针对个别基因进行基因治疗就能彻底治愈肿瘤。另外，