兽残分析中样品的采集、保存、制备与前处理技术及方法建立步骤

1兽残分析中样品的采集、保存、制备与前处理技术及方法建立步骤王永娟2残留分析的样品样品的前处理残留检测方法采样与样品制备（样品预处理）提取净化浓缩衍生化分辨检测样品处理测定分离残留分析原理兽药残留分析的过程31样品的采集、保存、制备1.1采样1.2样品封存1.3样品的保存运输1.4样品制备41.1.1抽样的基本原则严格按照规定的程序和方法执行，确保抽样工作的公正性和样品的代表性、真实性。51.1.2人员抽样人员不少于2人抽样人员应经过专门的培训，具备相应资质。抽样人员应携带身份证、工作证、单位介绍信、抽样单等文件。61.1.3工具肉类：不锈钢刀具、自带封口的食品卫生塑料包装袋、低温样品保存箱（盒）、一次性手套、标签、盛放微生物检验用样品的灭菌容器等。蛋类：洁净卫生的格状专用盛蛋盘、样品保存箱、一次性手套、标签、盛放微生物检验用样品的灭菌容器等。奶类：搅拌棒、取样器、温度计、塑料密封采样瓶、低温存奶箱、一次性手套、标签、盛放微生物检验用样品的灭菌容器等。蜂蜜：取样杆，取样瓶、一次性手套、标签、盛放微生物检验用样品的灭菌容器等。71.1.4组批饲养场：以同一养殖场、养殖条件相同、同一天或同一时段生产的产品为一检验批。屠宰场：以来源于同一地区、同一养殖场、同一时段屠宰的动物为一检验批。冷冻（冷藏）库：以企业明示的批号为一检验批。市场：以产品明示的批号为一检验批。81.1.5一个样品的组成及取样量血样：从颈静脉或前腔静脉取全血加抗凝剂。取样量为牛：50～100ml；羊和猪：20～50ml。尿样：收集清晨饲喂前的尿液100～200ml。蛋：从产蛋架上抽取，取样量不少于10枚；奶：从全场混合奶中取，取样量不少于1000ml。蜂蜜：每个样品量为1000克91.1.5一个组织样品的组成动物肌肉肝肾脂肪牛300-500克400-500克(取整叶)双肾各取1/2（纵切）200克羊300-500克400-500克(取整叶)双肾各取1/2（纵切）200克猪300-500克400-500克(取整叶)双肾各取1/2（纵切）200克鸡300-500克200-500克(取6只鸡全肝)6只鸡全肾50-100克(6只鸡脂肪)兔300-500克400-500克(取5只兔全肝)5只兔全肾5只兔脂肪101.1.6养殖场抽样数量猪、羊（尿样、血液）动物数量（样本数）抽样数（个）5055110081015001250015111.1.6养殖场抽样数量牛（尿样、血液、奶）动物数量（样本数）抽样数（个）5003501100071001500010500110000121000015121.1.6养殖场抽样数量家禽（蛋）动物数量（样本数，只）抽样数（个）100011001500035001100005100008131.1.6养殖场抽样数量-蜂蜜从每个蜂场抽取10％的蜂群，每一群随机取1张未封蜂坯，用分蜜机分离后取1000g。141.1.7屠宰厂抽样（动物组织）数量家畜（猪、羊）动物数量（样本数，头）抽样数（个）10051015008501200010200015151.1.7屠宰厂抽样（动物组织）数量家禽（鸡、鸭、鹅）、兔动物数量（样本数，只）抽样数（个）100011001500035001100005100008161.1.8蜂蜜加工厂（场）取样批量（件）最低取样数（件）＜50550－10010101－500每增加100，增取5＞501每增加100，增取2171.1.9市场样品采集鲜肉若成堆产品，则在堆放空间的四角和中间设采样点，每点从上、中、下三层取若干小块混为一份样品；若零散产品，则随机从3～5片胴体上取若干小块混为一份样品。每份500～1500克。冻肉小包装冻肉同批同质随机取3～5包混合，总量不得少于1000克。若成堆产品，取样方法同鲜肉。18鸡蛋按批次分别在货件不同部位随机抽样在50件以内者，抽检2件；50至100件者，抽检4件；101至500件者，每增加50件增抽1件（所增不足50件者，按50件计）；500件以上者，每增加100件增抽1件（所增不足100件者，按100件计算）。19液体乳品一般可采用虹吸法，或者用简单的玻璃管按不同深度分层取样。对于黏稠或含有固体悬浮或非均匀乳品应充分搅匀，然后再进行取样。总量应不少于500克。小包装、玻璃瓶装乳品按取样数量将内容物连同包装一起采样。均可以按照每一生产班次，或同一批号的产品，随机抽取原包装乳品2～4包/瓶。1.1.9市场样品采集20冷库、市场抽样数量检验批量（件）最少取样数（件）1-25126-1005101-25010251-50015501-1000171001-25002021组织样品的取样取样时不得将待取样品和已取样品进行任何洗涤处理，取样时用不锈钢手术剪或手术刀割取样品，戴一次性塑料手套操作。221.1.10缩分小样为保证样品检验结果的可重复性或能进一步仲裁，每个样品都应分成至少两个相同的小样，每个小样的数量都能满足每次进行完整分析的需要。分样可以在采样点或检验部门的实验室进行。分样时，必须避免污染或任何能引起残留物含量变化因素的产生。231.1.11抽样单填写样品编号：格式为[动物品种代码]/[样品种类代码]/[抽样日期]。例：2001年7月10日抽取的牛肝样品第一份，其编号为：B/L/010710-1。代码动物品种牛羊猪鸡兔鱼蜂蜜代码BOPCRFBe样品种类肌肉脂肪肝肾血液尿液蛋代码MFLKBUE样品种类奶蜂蜜心肺脑皮肤毛发代码MiHbHLuCSHa25采样单填写样品名称：所取样品的种类及部位。例：血样，全肝，背脊肉等。动物品种：所取样品动物的名称。年龄：牛、羊按年计，猪按月计，兔、鸡按日计。抽样基数：抽样当天的出栏率（养殖场）、屠宰量（屠宰厂）、存货量（冷库）。样本数量：所取样品的重量或体积。批号：样品所在批的批号，若无，则填“无”。保存情况：运输前所采取的保存方式、保存温度及持续时间。采样机构(盖章)采样人(签字)；采样日期；被采样单位负责人签名。26填写采样单的注意事项采样单填写的内容应真实、详实；应采用黑色钢笔或签字笔填写，字迹清楚，不潦草，不得涂改；采样单应填写完整，在采样人一栏至少应有两名采样人签字。填写抽样单最少一式三份，分别由抽样单位、被抽样单位（随留样保存）和行政主管部门各1份.271.2样品封存抽样人员和被检单位代表共同确认样品的真实性、代表性和有效性。将每份样品分别封存，粘贴封条。抽样人员和被检单位代表分别在封条上签字盖章。封样包装材料应清洁、干燥，不会对样品造成污染和伤害；包装容器应完整、结实、有一定抗压性。281.3样品保存运输为确保被分析物的稳定性和样品的完整性，采集的样品应由专人妥善保存，并在规定的时间内送达检测单位。取样后冻肉样应在冷冻状态下保存，蜂蜜：-10℃，禽蛋：0～4℃，牛奶：2～6℃条件下储存。生鲜样品取样后应在0℃～4℃条件下24小时内送达检测单位。运输工具应保持清洁无污染。防止贮存地点和装卸地点可造成的污染。291.4样品制备又称为样品预处理，主要指采样后至化学分析前试样的准备工作。不属于化学分析过程，仅是采样工作的继续。包括样品匀化、缩分、过筛、离心、过滤、防腐和抑制降解等过程。301.4.1样品的制备液体、浆体或悬浮液体:一般是将样品充分混匀搅拌。常用的搅拌工具有玻璃捧、电动搅拌器、液体采样器。互不相溶的液体:如油与水的混合物，分离后分别采取。固体样品:应先破碎或切分，然后捣碎、研磨或用其他方法研细、捣匀。常用工具有绞肉机、磨粉机、研钵、高速组织捣碎机等。罐头类:肉、鱼类罐头应预先清除骨头、调味料（葱、辣椒等）后再捣碎，常用高速组织捣碎机等。在制备过程中，应注意防止样品制备中易挥发性成分的逸散、避免样品制备中样品组成成分及理化性质发生变化、防止样品制备中的操作不当造成污染，而影响检测数据的准确性。311.4.2制样程序领取样品:从相关部门领取需要制备的样品，观察样品是否完好，如有腐败、变质、破损等非正常情况，应及时向发样部门反映，并停止制样，保存样品。如样品完好，则可开始制备样品。制备样品:根据样品性质、状态，选择适当的制备方法制备样品。填写制样单:样品制备完毕后，应认真填写制样单，记录制样过程，制样单的内容包括：样品名称、样品状态、制样时间、制样间温度等。存放样品:制样单填写完毕后，制备的样品应交与检测人员检测或放入指定地点保存以供检测人员检测取用。322样品前处理2.1概述2.2提取方法2.3净化方法2.4浓缩与富集2.5化学衍生化技术332.1样品处理-概述目的:将待测组分从样品基质中分离出来，并达到仪器能够检测的状态。主要作用包括:将药物从样品中释放出来、除去样品中的干扰杂质、将待测组分转换为可检测的形式、达到可检测的浓度范围和溶于可进行分析的介质。主要包括四项基本内容：提取、净化、浓缩、衍生化。分离或组分转移是贯穿整个样品处理过程的基本问题：液-液萃取、固相萃取34样品处理-概述实际中每个处理步骤和方法不是固定和孤立的，在程序或作用上有时看不出明显界限。如固相萃取可用于提取、净化、浓缩和富集；浓缩既是提高组分浓度的手段，又是溶剂转移和提高萃取效率的常用方法。样品处理技术涉及因素多，操作复杂，方法灵活，直接影响个分析指标、成本和效率，一般占用70%以上的分析工作量。352.2提取方法提取（extraction)：用物理的或化学的手段破坏待测组分与样品成分间的结合力，将待测组分从样品中释放出来并转移到易于分析的溶液状态。提取平衡：待测物、样品基质、溶剂相似相溶原理提取过程首先应保证最大回收率，其次是减少样品基质的共萃取提取过程常与样品制备过程一同进行，如匀浆、抑制样品降解。362.2.1样品类型尿液：不会乳化，但成分复杂，不稳定，与组织浓度相关性差，分析前需调节pH值和水解轭合物，pH4-9。血浆：主要成分为水(90-93%)和可溶性蛋白(7%)。血浆成分较尿液复杂，组成和性质比较稳定，血药浓度与组织浓度密切相关，pH7.24-7.54。胆汁：成分复杂且不稳定，与尿液相似，分析前需调节pH值和水解轭合物，pH6.1-8.6，水分80-96%。奶：主要成分为水（87%）、蛋白质（3.3%）、脂肪（3.7%）、糖类（4.7%），可称为混悬有脂肪微粒的血浆，pH6.7。蛋：蛋黄主要成分为水（50%）、蛋白质（16.5%）、脂肪（33%）、糖类，为疏水性环境，极性低的药物残留多，pH6.0-6.8；蛋清主要为水（88%）和蛋白质（10.5%）。分析前需调节pH值，pH7.5-9.4。动物组织：肌肉的主要成分为水（75%）、蛋白质（19%）、脂肪（2.5%）、糖类（1.2%），pH5.7。不同动物肌肉成分有差异。肝、肾为药物的代谢或排泄器官，残留物浓度高，消除缓慢。372.2.2提取溶剂的选择遵循相似相溶的原则对待测组分溶解度大对于干扰杂质溶解度小与样本基质有较好的相容性能有效释放药物具有脱蛋白和/或脱脂肪能力其他：沸点适中、黏度小、毒性低、易纯化、价格低廉、易于进一步净化。38常用提取溶剂乙腈、甲醇、丙酮：与样品容易混合；易于操作；溶剂化作用和渗透能力强，黏度小，提取速度快；能使结合态的药物释放；脱蛋白和脂肪；提取液pH可以调节；带测组分在提取样品液中均匀分布；可定量移取提取液进行分析。混合溶剂：乙腈-甲醇、氯仿-甲醇、乙腈-水、己烷-丙酮等。二甲基亚砜、二甲基甲酰胺：沸点高，净化中难以除去。非水溶性的极性溶剂：乙酸乙酯、二氯甲烷、氯仿、乙醚：脂溶性残留物无水硫酸钠：通过盐析作用提高组织样品待测物的回收率。392.2.3提取方法如何提高提取速度？提高样品的破碎程度，以增加扩散面积，减少扩散距离搅拌和重复提取延长提取时间使用黏度小的溶剂，适当提高温度402.2.3提取方法

组织捣碎法:又称匀浆提取法,一般将样品和3-5倍样品体积的溶剂加入捣碎杯,高速搅拌或匀浆。将样品过滤或离心后移取提取液，残渣重复提取1-2次，合并提取液进行净化。不需要加热，速度快，提取效果好。41振荡法：将样品和适量溶剂加入具塞锥形瓶，中速振荡30分钟或更长时间，样品液过滤或离心后移取提取液即可。该方法操作简便，可同时对多个样品进行提取。常加无水硫酸钠以提高回收率。2.2.3提取方法42索氏提取法：使用索氏提取器进行提取。要考虑组分的热稳定性，保证组分在长时间回流过程中不分解。该方法操作简便，不需要转移样品，不受样品基质影响，是一种彻底提取法。但提取时间长，耗用较多溶剂（每个样品300-500毫升），需要对提取液进行浓缩。适用于水分较少的样品的提取。2.2.3提取方法43超声波辅助提取：将样品和溶剂放于密闭的试管中，置于具有一定能量的超声波水浴中，数秒钟拿出，再放入、拿出。该方法操作简单、一次可同时提取多个样品。提取时间短、速度快、提取效率高。但要耗用大量的溶剂每个样品（300-500毫升），。2.2.3提取方法44超临界流体萃取：使用超临界流体萃取仪原理：超临界流体为兼具气态和液态性质的特殊状态，萃取的速度快。特点：速度快，选择性强，易于净化。获得的样品可以直接进行分析，如进行GC或HPLC测定等。2.2.3提取方法45强化溶剂萃取：是由超临界流体萃取衍生出来的一种提取方法。采用溶剂作流体，在高温、高压下提取样品。其操作温度比索氏提取发高，从而使溶剂具有更强的溶解能力。与索氏提取相比，速度快（10-20分钟），溶剂用量小（15毫升）。设备价格昂贵。2.2.3提取方法46微波辅助萃取：需要微波萃取装置。提高萃取效率：微波激活作用、提高溶剂活性2.2.3提取方法47样品的消解：主要用于常规方法无法提取的样品基质（毛发、角质、骨头等）、组织结合力强的组分、结合残留或轭合残留物的处理酸消解法：对耐酸的药物如有机氯农药。消解试剂如高氯酸-冰乙酸混合液、稀盐酸等。温度在80-90℃。消解开始时应充分振荡或搅拌，是样品分散。试剂用量一般为样品量的2-3倍。碱消解法：主要用于动物样品的消解，如鱼肉、蛋、奶制品等。试剂有甲醇钠、乙醇钠、甲醇钾、乙醇钾。温度为60度。样品易发生乳化。酶消解法：主要用于组织蛋白、轭合物和结合物的水解，使药物被释放。常用的蛋白水解酶为枯草杆菌溶素和胰蛋白酶等。轭合物水解没有β-葡糖苷酸酶和芳基硫酸酶等。酶水解条件温和，但酶制剂价格高，水解时间长，有时会有更多杂质被释放，加重净化负担。2.2.3提取方法48冷冻干燥：先将样品冷冻，置入冻干机内进行减压干燥，除去挥发性杂质，向残渣中加入有机溶剂进行萃取。适用于含水样品中热稳定性差、水溶性的组分的预处理。制备“干混合物”：将样品与足量的无水硫酸钠或硫酸镁混合研磨，然后用溶剂萃取或装柱淋洗。起泡分离：利用泡沫除去溶解的物质，常用于浓缩和分离水中的洗涤剂后其他表面活性剂。2.2.3提取方法492.2.4提取效率使用同位素标记的组分进行回收率试验使用公认的彻底提取法比较测定结果选定方法的比较与重复502.3净化方法提取过程中许多与待测组分溶解性相似的杂质被一起转移出来。将待测组分与杂质分离的过程。提取过程一般可以除去99%以上的样品基质，不到1%的共萃取物是主要的干扰物质。杂质：增加基线噪音、降低柱效、阻塞色谱管路、污染色谱柱和检测器。或干扰色谱分离过程，导致待测物峰形异常和保留值变异增加。还可能影响衍生化反应。杂质的存在将直接影响定性和定量的质量，使检测限升高和变异增加。512.3.1液-液萃取是一种利用待测组分与样品杂质在互不相溶的两相中溶解性差异进行净化的方法。原理：分配常数影响因素：溶剂、pH、离子对试剂、盐析、其他操作方法：分液漏斗震荡法、涡旋萃取、逆逆流萃取、特殊容器萃取等脱水、乳化、吸附损失522.3.2固相萃取优点：可以净化很小体积的样品、溶剂用量小、选择性高、速度快、不会发生乳化、引入杂质少。SPE柱结构:柱体、固定相和滤板3部分。固定相类型：正相、反相、离子交换相固定相的选择：非极性或低极性选用反相固定相，中等极性物质反相或正相固定相均可应用，离子型或较强的有机酸、有机碱可选择离子交换固定相为保证上样时样品被充分保留，样品介质应为弱溶剂。固相萃取分离机制与溶剂选择分离机制弱溶剂（保留条件）强溶剂（洗脱条件）反相水、缓冲液或低浓度的甲醇或乙腈甲醇、乙腈或溶剂与水的混合物正相正己烷、甲苯等二氯甲烷、甲醇等阳离子交换低离子强度缓冲液高离子强度缓冲液低反离子强度高反离子强度pH＞固定相pKapH＜固定相pKapH＜分析物pKapH＞分析物pKa阴离子交换低离子强度缓冲液高离子强度缓冲液低反离子强度高反离子强度pH＜固定相pKapH＞固定相pKapH＞分析物pKapH＜分析物pKa54SPE方法的建立和操作-固定相活化目的是创造一定的溶剂环境和除去柱内杂质。一般首先使用一种强洗脱能力的溶剂（始溶剂）润湿和净化SPE柱，然后再用弱洗脱能力的溶剂（终溶剂）平衡SPE柱。一般每100毫克固定相用1-2毫升溶剂平衡。活化过程中和上样前不要让柱内液体流干和空气进入，否则柱床会出现裂隙，影响回收率、重复性和净化效果。终溶剂的强度与样品溶剂接近或更低，以免样品被带出造成回收率下降。活化对净化效果十分重要，不当的活化常是导致净化失败和分析误差的来源55SPE方法的建立和操作-样品上柱SPE柱容量一般为固定相中重量的1%-3%。流速越低，净化效果越好，一般1-10毫升/分钟。稳定的流速对保证净化的重复性是重要的。在保证样品溶解时应尽可能使用弱溶剂溶解样品，使组分在柱上有强保留，用较小溶剂体积即可将组分洗脱，也可减少杂质流出。样品的溶剂强度过高或体积过大可能造成穿漏，是回收率降低。有时样品必须用强溶剂提取，可用弱溶剂稀释至适宜的强度。56SPE方法的建立和操作-洗涤、洗脱洗涤：是为了除去不需要的组分或杂质，所用溶剂一般略强于或等于样品溶剂。洗脱：洗脱溶剂必须谨慎选择，以保证用较小体积的溶剂将组分淋洗下来，并且避免溶剂太强洗出不必要的组分。洗涤或洗脱溶剂的体积一般为0.5-0.8毫升/100毫克。使用混合溶剂是获得适宜强度溶剂的有效方法。利用洗脱分布图可以快速选择溶剂和固定相。572.3.3基质固相分散技术其基本操作是将样品直接与适量反相键合硅胶一起混合和研磨，使样品被均匀分散于固定相颗粒表面，制成半固态装柱，然后用类似与SPE的操作进行洗涤和洗脱。样品与填料的比例通常为1：4特点：处理样品速度快，溶剂用量少，但样品量小，要求检测方法具有较高的灵敏度。582.3.4免疫亲合色谱使用连接有抗体的惰性基质作为固定相。对某种或某类残留组分选择性吸附和富集，是残留分析中有效的净化方法之一。免疫吸附柱能重复使用592.3.5制备色谱法包括制备HPLC和TLC制备HPLC通常作为一种补充手段，用于常规方法难以净化的样品或对净化要求高的分析方法。将样品溶液注入制备型液相色谱仪，收集一定时间段的流出组分，浓缩后测定。制备TLC净化中，经点样、展开和干燥后将药物斑点剥离，用溶剂将药物浸出，浓缩后测定。602.3.6其他膜分离技术分子印迹技术凝胶渗透色谱固相微量萃取：是一种基于液-固吸附平衡的样品富集方法，是一种无溶剂萃取方法，适用于挥发性或半挥发性组分的测定。吹扫-捕集：是用惰性气体将液体样品或样品提取液中的挥发性物质驱赶到气相中，再带入一个收集阱中收集后进行分析。用于环境样品或高脂肪样品中挥发性物质的净化。浸透限制固定相：可选择性地保留小分子药物而排除大分子蛋白质，达到净化和富集的目的。磺化：浓硫酸与样品中的脂肪、油脂、蜡质或色素等干扰物质反应，生成高极性的水溶性产物，经有机溶剂分配后除去。低温冷冻：动物组织中的脂肪、蜡质和水分等杂质在低温溶剂中沉淀析出，经离心或过滤后除去。凝结剂沉淀法：将提取液浓缩，样品溶于丙酮，加入凝结剂使蛋白、色素等杂质沉淀除去，常用于水溶性较高组分的净化。61膜分离技术膜分离是利用溶质分子的大小、形状和性质等差异，对薄膜表现不同的通透性而达到分离或净化的目的。超滤(ultrafiltration)、渗析(dialysis)、反渗透(reserveosmosis)自动序列渗析/痕量富集系统(automatedsequentialtraceenrichmentofdialysates)62也被称为空间排阻色谱（SEC）。该方法基于尺寸排阻的分离原理，利用样品中各组分分子大小不同，从而在凝胶中滞留时间不同而达到分离目的。凝胶渗透色谱（GPC）不仅可以用于分离和测定小分子物质，而且还可以用于分析具有相同化学性质但分子大小不同的高分子量物质。凝胶渗透色谱（GPC）63

分子印迹技术分自印迹技术是以目标分子为模板，与功能单体通过共价键或非共价键的方式结合，再加入交联剂进行聚合反应。印迹分子(模板)除去后，聚合物中留下了大量的空穴，这些空穴和模板分子在大小及形状方而完全匹配。即“分子记忆”引入到聚合物中，该聚合物就具有反结合模板分子的选择性能。以分子印迹聚合物(molecularlyimprintedpolymers,MIPs)作为固定相。642.4浓缩与富集旋转蒸发器浓缩：速度快，溶剂可以回收。气流吹蒸法K-D浓缩器：能使浓缩、回流、洗涤和定容同时进行。真空离心浓缩法：用于热敏性组分或粘稠液体的浓缩。浓缩过程中组分最易损失，稳定性差、蒸汽压或极性高的待测物损失更明显。蒸发温度不易过高，吹蒸速度不宜过快，不要将样品直接蒸干（加入乙二醇、硬脂酸或液体石蜡作为保持剂）。必须干燥时最后缓缓吹入氮气或空气。652.5化学衍生化技术是指通过化学反应使待测组分定量生成适合于特定分析条件的化合物的一种方法目的：提高检测的灵敏度与选择性；改善色谱分离；提高理化稳定性；分离结构相似的组分；辅助定性。要求：反应速度快；反应易重复；定量完全；产物易纯化；色谱行为良好、易于分离和检测662.5.1GC衍生化方法硅烷化:凡结构中含有活泼氢或可烯醇化酮基的化合物均可被硅烷化,常用试剂为三甲基硅烷化试剂,反应介质一般为甲苯、乙醚、二甲基甲酰胺、乙腈、吡啶。操作用防止带入水分。酰化：用于羟基、氨基和巯基的衍生化，常用的衍生化试剂为酸酐和卤代酸酐，如乙酸酐、苯甲酸酐、乙酰氯、三氟乙酸酐等。咪唑类在衍生化过程中不产生酸，对促进反应和产物的稳定性有利。一般在吡啶中，室温下进行。酯化或烷基化：用于羧酸和其他酸性基团的衍生