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文档简介

实验七黑曲霉发酵生产柠檬酸实验目的了解产物发酵生产的机理；

柠檬酸发酵的发酵条件掌握发酵过程步骤黑曲霉中存在TCA的酶系柠檬酸的发酵的过程80%的糖代谢走EMP途径柠檬酸发酵的条件

1、合适的碳源（淀粉、麦芽糖、甘露糖等），高浓度的糖；2、限制有机氮源、选择适量的无机氮源（铵盐）；

孢子培养基

：要求能使菌体迅速生长，产生较多优质的孢子，所以营养不要太丰富；

发酵培养基：既要使菌体能迅速生长，达到一定的菌丝浓度，又要使长好的菌体能迅速合成所需产物

；3、合适的pH值，黑曲霉在pH为2～3的环境中发酵糖，产物以柠檬酸为主；当pH接近中性时则大量产生草酸，而柠檬酸产量很低；

4、发酵液中溶氧量要高（摇床的转速250r/m）；5、限制重金属离子，如Mn2＋缺乏促进EMP途径畅通，

控制Fe2＋含量使顺乌头酸酶活力降低，使柠檬酸积累。实验步骤菌种获得孢子悬液制备

取约5mL无菌水至黑曲霉平板上，用灭菌滴管轻轻刮下孢子，振荡数下制成孢子悬液。

液体深层发酵

取约4mL孢子悬液接种于玉米粉摇瓶发酵培养基中。在转速为200rpm旋转摇床上，30℃培养5～6天。牛肉膏蛋白胨培养基（1.5L，分装10只250mL三角瓶）

牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl5g,琼脂15g，水1000mL,pH7.4～7.6。制法：溶解分装后121℃灭菌20min。改良CHALMERS培养基（1.5L，分装10只250mL三角瓶）

大豆蛋白胨5g，牛肉浸膏5g，酵母浸膏5g，葡萄糖10g，乳糖20g，碳酸钙10g，琼脂15g，水1000mL，pH7.4～7.6，1%中性红溶液5mL。制法：溶解分装后121℃灭菌20min。

灭菌自来水（20mL，于50mL三角瓶）

每组2瓶，其中一瓶放置数颗玻璃珠其他灭菌物品（每组1套）

小包装1.5mL离心管、蓝色黄色枪头若干，培养皿每组1包（每包不少于6个）问题与思考影响黑曲霉发酵生产柠檬酸的因素有哪些？黑曲霉柠檬酸pH控制黑曲霉柠檬酸生产菌生长发育适宜PH3～7。在含糖合成培养基中，分生孢子在PH6.8—7.2发芽良好．若起始pH较低(例如4.5以下)，会强烈抑制它的发育。在PH2.5以下，分生孢子不膨胀．当pH大于7.5时分生孢子会剧烈膨胀，甚至破裂。一般认为柠檬酸发酵在菌种生长期，pH维持在4.5，而柠檬酸积累时即产酸期的最适PH2.0～3.0，pH3.0以上容易产生草酸，在pH5.0容易生成葡萄糖酸(葡萄糖氧化酶最适PH5.6)，在PH3.0以下是柠檬酸积累的条件。采用淀粉或薯干粉等原料的柠檬酸发酵过程中，淀粉的糖化和柠檬酸的生成和积累，是处在同一个环境中，都是由黑曲霉柠檬酸产生菌完成的。发酵的技术关键是兼顾糖化和产酸，要保证糖化速度和产酸速度之间的衔接与平衡。黑曲霉柠檬酸生产菌的酸性糖化酶的最适PH为4.0～4.6．随着pH的下降，尤其当PH降至2.2时，液化酶和糖化酶会大量破坏，而柠檬酸发酵的最佳PH是2.0以下。要解决两者矛盾，可采用下列方法：

(1)采用酸性平扳驯化，分离在

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