临床微生物学

临床微生物学概论

（第一部分）复旦大学附属华山医院抗生素研究所2标本采集细菌的分离培养和鉴定抗菌药物敏感性试验主要内容3正常菌群在正常人体体表与外界相通的腔道：口腔、鼻咽腔、肠道、泌尿生殖道存在的多种微生物。在机体免疫功能正常时对人体有益无害，属人类正常微生物群或环境中通常不致病的微生物，因以细菌和真菌为主，故称“正常菌群”。正常菌群的存在是保持人体健康的重要因素反映出在正常情况下，宿主、正常菌群和外界环境相互适应，保持平衡状态。45病原微生物病原微生物(pathogen)：引起人类感染性疾病的微生物称为病原微生物或致病微生物。细菌：如痢疾志贺菌、肠杆菌科细菌、金黄色葡萄球菌、肠球菌属等病毒：如单纯疱疹病毒、巨细胞病毒、乙型肝炎病毒等真菌：如念珠菌属、曲霉属、毛霉属以及新型隐球菌等其他：如支原体、衣原体、螺旋体6临床常见的病原微生物革兰阳性菌：葡萄球菌、溶血性链球菌、肠球菌革兰阴性菌：需氧球菌：脑膜炎和淋病奈瑟球菌、卡他莫拉菌需氧杆菌：不动杆菌、假单胞菌、产碱杆菌、嗜血杆菌需氧和兼性厌氧：肠杆菌科细菌如大肠杆菌、肺杆、伤寒、志贺菌。厌氧细菌：脆弱拟杆菌、痤疮丙酸杆菌等7苛养菌定义：是一类生长需要特殊营养物质的细菌，与许多感染性疾病有关，其分离培养较为困难。营养要求高肺炎链球菌：培养基内要加入血或血清流感嗜血杆菌：X、V因子比较娇嫩、对干燥、对寒冷的抵抗力均较弱。培养条件：5～10％CO2、35℃培养、24～48h呼吸道其他快生长细菌的覆盖使分离率非常低8厌氧菌是一群专性厌氧，必须在无氧环境下才能生长繁殖的细菌。根据能否形成芽胞，可将厌氧菌分成两大类。厌氧芽胞梭菌属无芽胞厌氧菌厌氧芽胞梭菌属：破伤风梭菌、产气荚膜杆菌、肉毒梭菌、艰难梭菌无芽胞厌氧菌：拟杆菌属、梭杆菌属、丙酸杆菌属、消化链球菌属等9标本的采集抗菌药使用前正确的部位正确的时间足够的数量无菌的容器特殊要求应在化验单上注明10主要的临床标本种类标本类型呼吸道标本深部咳出痰、支气管灌洗液咽拭子、鼻气管吸出液、气管吸出液尿液血液脑脊液伤口、脓液其它体液胸水、心包液、引流液、腹水、滑囊液11标本的处理涂片光镜检查诊断病原最基本和快速的方法：脑脊液直接形态学检查革兰染色或特殊染色分离培养和鉴定动物接种免疫学检查12痰标本主要病原菌：肺炎链球菌，克雷伯菌属，流感嗜血杆菌，金黄色葡萄球菌，铜绿假单胞菌。非病原菌：酵母菌，草绿色链球菌，凝固酶阴性葡萄球菌病人需用水清洁口腔，深咳肺部痰，不要唾液#1进行革兰染色以评价标本是否适于接种。向临床医生尽快报告重要的革兰染色结果#2#3好：很少扁平上皮细胞奥普托欣纸片CO2中孵育48小时#4接种巧克力平皿，血平皿和麦康凯平皿#5拒绝：大量扁平上皮细胞肺炎克雷伯菌对重要病原菌进行鉴定&药敏试验金黄色葡萄球菌肺炎链球菌胆汁溶菌＋奥普托欣＋流感嗜血杆菌13革兰染色评估呼吸道标本是否合格？有代表性的好标本中性粒细胞多白细胞>25/低倍视野鳞状上皮细胞少＜10/低倍视野14痰标本>10鳞状上皮细胞/每低倍视野=拒收19#1bab尿培养主要病原菌：大肠埃希菌，变形杆菌，克雷伯菌，其他革兰阴性杆菌，肠球菌，腐生葡萄球菌，纯的金葡球菌#2接种血平皿和麦康凯平皿#3空气孵育24小时收集中段尿a#4菌落计数0.001ml接种环若2种菌生长，对每种菌进行鉴定和药敏试验；若>2种菌生长，报告“混合菌群”#5注意:革兰阴性杆菌在血平皿和麦康凯平皿上均生长良好革兰阳性球菌仅在血平皿上生长良好GNR#675,000cfu/ml50,000cfu/ml100,000cfu/mlGPC20脓，吸取物或组织标本主要病原菌：金葡菌，化脓链球菌，其他β溶血链球菌，绿脓，其他革兰阴性杆菌。非病原菌：凝固酶阴性葡萄球菌，少量的棒状革兰阳性杆菌用酒精消毒伤口周围皮肤最好的标本是吸取物和组织最差的标本是拭子#1接种血平皿和麦康凯平皿如果是吸取物或组织，进行革兰染色，将重要结果通知临床医生#2#3铜绿假单胞菌中孵育48小时#4对1或2种重要病原菌进行鉴定&药敏试验金黄色葡萄球菌为主β溶血链球菌肺炎克雷伯菌混合的2种肠道革兰阴性杆菌：2种均报告；当检出3种或更多病原菌时，报告“混合菌丛”并描述性列出假单胞菌，金葡菌，变形杆菌，肠道革兰阴性杆菌等。#521血培养主要病原菌：沙门菌、布氏杆菌、其他革兰阴性杆菌、金葡菌、肺链、流感以下菌应视为非病原菌(除非>1次血培养分离出)：芽孢杆菌属、凝固酶阴性葡萄球菌、草绿色链球菌、棒状革兰阳性杆菌从两个独立的皮肤位点采血，每瓶采集10ml#135℃自动化仪器中孵育5天每天检查浊度并翻转培养瓶#2#318小时后传进行次代培养当培养瓶显示细菌生长时进行革兰染色和传代培养革兰阳性球菌接种血平皿＋奥普托欣试验革兰阴性杆菌接种血平皿和麦康凯平皿革兰阴性双球菌或球杆菌接种巧克力平皿和血平皿CO2中孵育72h#5#4将重要的革兰染色结果尽快通知临床医生对重要病原菌进行鉴定和药敏试验#6例如：肺炎克雷伯菌例如：肺炎链球菌22细菌的分离培养标本类型5%脱纤维羊血平皿巧克力平皿中国兰平皿血培养瓶厌氧培养瓶呼吸道标本√√√尿液标本√（菌落计数）√血液标本√√其他无菌体腔标本√√23细菌的分离培养按实验室常规接种于培养基培养条件：35℃24-48小时或5%-10%CO235℃24-48小时厌氧培养28具有特殊性状的细菌葡萄球菌铜绿假单胞菌溶血性链球菌29具有特殊性状的细菌矛头状自溶现象芽胞30细菌的鉴定表型分类法以细菌的形态、结构、生理、生化和血清学反应等细菌的表型为主要依据分子生物学技术基因诊断依据分析DNA的碱基组成，基因片段的大小，与比较DNA的同源性关系，从而分析细菌DNA的亲缘关系。31流感嗜血杆菌的卫星现象32菌种鉴定—鉴定到种根据纯分细菌的形态、菌落特征，特征性的生化反应，选择合适的细菌鉴定系统。如手工的API条和半自动的ATB肠杆菌科细菌：API20E非发酵革兰阴性杆菌：API20NE葡萄球菌属：SlidexStaphPlus、APIStaph链球菌属：SlidexStreptoKit、APIStrep奈瑟菌属、嗜血杆菌属：APINH厌氧菌：API20A33菌种鉴定—鉴定到种自动细菌鉴定/药敏仪VITEK2CompactBDPhoenixSystem

MicroScanBIOMICV3微生物鉴定系统BIOFOSUN微生物鉴定系统鉴定到种葡萄球菌？金黄色葡萄球菌！

细菌鉴定和药敏试验快速化是未来的趋势张嵘教授课件内容张嵘教授课件内容张嵘教授课件内容CTX-M-14（+）生理盐水头孢噻肟CTX-M-14（-）质谱检测黏菌素耐药鲍曼不动杆菌ClinicalInfectiousDiseases2015;60(9):1295–303敏感株耐药株张嵘教授课件内容39抗菌药物敏感性试验40抗菌药物和药敏试验抗菌药物是指具有杀菌或抑菌活性的抗生素和化学合成药物。前者是真菌、放线菌、细菌等的代谢产物，后者是经化学改造的半合成抗生素和化学合成药物。测定抗菌药物在体外对病原微生物有无抑菌或杀菌作用的方法称为药物敏感性试验（AntimicrobialSusceptibilityTesting,AST），简称药敏试验。41抗菌药物敏感性试验的意义无法推测敏感或耐药病人个体化治疗指南提供经验治疗的依据建立当地或国家处方政策监测流行病学趋势监测细菌耐药性测试新抗菌药物的抗菌活性

检测新耐药机制的方法42抗菌药物敏感性试验分类定量方法(MIC,mg/L)琼脂稀释法肉汤稀释法E-test定性方法(SIR)纸片扩散法自动化仪器稀释法的定义以一定浓度的抗菌药与含有被试菌株的培养基进行一系列对倍数稀释，经培养后肉眼观察未见细菌生长管内所含的最低药物浓度为该药对该试验菌的最低抑菌浓度(minimalinhibitoryconcentration,MIC)稀释法的最大优点是可以精确测得药物最低抑菌浓度，但需耗费较多材料、人力和时间。稀释法的分类稀释法药敏试验因介质不同可分为液体稀释法和琼脂稀释法。因容器不同分为试管稀释法和微量稀释法，或称常量法和微量。前者使用无菌的13mm×100mm试管，每一浓度抗菌药的量至少为1ml；后者使用8×12的U型底小孔的微量稀释板，小孔内装有0.1ml肉汤。琼脂稀释法又因在平皿中进行而称为平皿稀释法。微量稀释法的优点为试剂材料较节省，而且微量板中可预先配制好抗菌药和培养基，冷藏后一定时期内使用，较为方便。与试管稀释法相比，琼脂稀释法配合多点接种器使用，可同时进行大量菌株的药敏试验，实验结果重复性好，缺点是不能进行最低杀菌浓度(minimalbactericidalconcentration,MBC)的测定。与稀释法药敏试验有关的指标有哪些？MIC：最低抑菌浓度MBC：最低杀菌浓度MIC50：抑制50%受试菌株的MIC值MIC90：抑制90%受试菌株的MIC值MBC50：杀死50%受试菌株的MBC值MBC90：杀死90%受试菌株的MBC值药物浓度菌株数累积菌株数MIC50MIC900.125110.25230.514104226242882108琼脂稀释法琼脂选择法是将药物混匀于琼脂培养基中，配制含不同浓度药物平板，使用多点接种器接种细菌。经孵育后观察细菌生长情况，以抑制细菌生长的琼脂平板所含药物浓度为最低抑菌浓度（minimalinhibitoryconcentration，MIC）试验菌的结果报告可用MIC（ug/ml）或用敏感(S)、中介(I)和耐药(R)报告。816多点接种仪试管稀释法试管稀释法0.060.1250.250.512481632MIC＝1ug/ml微量稀释法0.060.1250.250.51248163264128ABCDEFGH微量稀释法微量稀释法结果阅读E-试验E试验原理E试条（E-test）是一条5mm×50mm的无孔试剂载体，一面固定有预先制备的，浓度呈连续指数增长稀释抗生素，另一面有读数和判别的刻度。将E试条放在细菌接种过的琼脂平板上，经孵育过夜，围绕试条明显可见椭圆形抑菌圈，圈边缘与试条交点的刻度浓度即为抗菌药物对细菌的最低抑菌浓度（MIC）结果判断和报告读取椭圆抑菌环与E试验试条的交界点刻度值E-试验结果阅读纸片扩散法58纸片扩散法原理将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测试菌的琼脂平板上纸片中所含的药物吸收琼脂中水分溶解后不断向纸片周围扩散形成递减的梯度浓度在纸片周围抑菌浓度范围内测试菌的生长被抑制，从而形成无菌生长的透明圈即为抑菌圈。59纸片扩散法结果图60规范化的药敏试验方法-扩散法(纸片法)

原理：将浸有抗菌药物的纸片贴在涂有细菌的琼脂平板上，抗菌药物在琼脂内向四周扩散，因此敏感细菌在纸片周围一定距离内的生长受到抑制，根据抑菌圈的大小即可推知该药物的最低抑菌浓度（MIC）。61如何正确挑取细菌？菌落？

至少3个菌落，为什么？可能丢失耐药细菌(携带有耐药质粒的耐药菌株)….62正确的接种菌量扩散法：0.5麦氏浊度（1.5×108CFU/ml）SelectcoloniesPrepareinoculumsuspension63充分混匀标准浊度菌苔厚度的要求

ClinMicrobiolInfect2014;20:O831–O839JAntimicrobChemother,2010;65:249-251接种菌量升高导致MIC升高接种菌量升高导致改良Hodge试验假阳性升高DMID,2004;49:41-46.67合适的培养基厚度普通细菌MH琼脂培养基（Mueller－HintonAgar）培养基厚度：4mm肺炎链球菌及其他链球菌5％脱纤维羊血＋MH琼脂培养基嗜血杆菌属 嗜血杆菌培养基（HTM）＋SR158添加剂错误做法：采用血琼脂做肠球菌的药敏试验684.合适的培养条件需氧菌：35℃±2℃，16-18小时嗜麦芽窄食单胞菌、洋葱伯克霍尔德菌：20-24小时葡萄球菌：33-35℃，苯唑西林、万古霉素24小时肠球菌：万古霉素-24小时溶血性链球菌、肺炎链球菌、奈瑟氏菌属等：20-24小时695.正确阅读结果（纸片法）工具：游标卡尺，尺子光源：反射光、透射光阅读：药敏平皿背衬不反光的黑色背景用肉眼观察也可用机器阅读抑菌圈直径抑菌圈边缘微弱生长的、仅能在放大镜下才能观察到的细小菌落应忽略70正确测量苯唑西林、万古霉素和利奈唑胺对葡萄球菌；以及万古霉素对肠球菌的抑菌圈直径透射光反射光70不要用反射光要使用透射光抑菌圈内有菌落，怎么办？大肠埃希菌污染有肠球菌菌落再次纯分铜绿假单胞菌有耐药菌落73CLSI文件：我国部颁标准74结果判断和报告：纸片扩散法

——1株细菌1个药1个标准用精确度为1mm的游标卡尺量取抑菌圈直径。通常采用CLSI公布的药敏结果判断标准，采用三级划分制。临床实验室标准化协会(ClinicalandLaboratoryStandardsInstitute,CLSI是我国的部颁标准肠杆菌科细菌判断标准结果判断和报告：稀释法

——1株细菌1个药1个标准76结果判断和报告敏感（Susceptible）：当一种细菌引起的感染，用某种药物常规量治疗有效，这种细菌即对该药高度敏感。中度敏感（Intermediate）：当细菌引起的感染仅在应用高剂量抗菌药物时有效，或者细菌处于体内抗菌药物浓缩的部位或体液（如尿、胆汁、肠腔等）中时才被抑制，这种细菌对该药仅呈中度敏感。耐药（Resistance）：药物对某一细菌的药敏高于药物在血或体液内可能达到的浓度时，有时细菌能产生灭活抗菌药物的酶，则不论其MIC值大小如何，仍应判定该菌为耐药。例如产青霉素酶的金葡菌即应认为该菌对青霉素耐药。776.重要的质控菌肠杆菌科细菌：大肠埃希菌ATCC25922非发酵菌：铜绿假单胞菌ATCC27853葡萄球菌：金黄色葡萄球菌ATCC25923肠球菌：粪肠球菌ATCC29212肺炎链球菌：肺炎链球菌ATCC49619嗜血杆菌：流感嗜血杆菌ATCC49247

78改变条件对于质控的要求要求质控的连续天数方法改变1520或30药敏纸片更换新的批号☆更换新的厂家☆更换新的品种☆培养基（配置药敏平板）更换新的批号☆更换新的厂家☆79改变条件对于质控的要求要求质控的连续天数方法改变1520或30接种物准备校准更换的使用设备☆校准操作者技术☆测量抑菌圈方法改变☆仪器/软件软件的更新☆仪器的修理☆80纸片法药敏试验结果异常分析81天然耐药82（二）正确的抗菌药物组合原则：针对监测细菌设计监测药物的品种和数量CLSI抗菌药物选择的原则（A、B、C、U组）根据病原菌的种类革兰阳性球菌葡萄球菌、肠球菌、链球菌等革兰阴性杆菌肠杆菌科细菌、铜绿假单胞菌、不动杆菌等根据本单位临床实际需要83FDA批准临床微生物室常规药敏试验分组抗菌药：A.为常规的一级(一线)试验组合并常规报告结果B.亦可用于一级(一线)试验，但应选择性报告，即当A组药物耐药时可以选择性地报告B组中的同类药物C.为补充性药物，可选择性报告U.为补充性药物,仅用于治疗尿路感染的选择用药8384补充性药物选择性报告的原则对一线试验组合的药物耐药身体特殊部位患者不能接受一线试验组合的药物一线试验组合的药物对患者无效复数菌感染多部位感染8485肠杆菌科细菌的抗菌药物选择抗菌药物ABCU抗菌药物ABCUO阿米卡星√亚胺培南√庆大霉素√美罗培南√氨苄西林√厄他培南√哌拉西林√环丙沙星√头孢唑啉√氨苄西林/舒巴坦√头孢克罗√头孢哌酮/舒巴坦√头孢呋辛√哌拉西林/他唑巴坦√