免疫学检验的质量控制

免疫学检验第三十章

免疫学检验的质量控制

掌握免疫学检验质量控制的相关概念。掌握标准品的分类及基本条件。掌握定量、半定量和定性免疫检验的方法类型熟悉室间质量评价的方式、评分及意义。学会常用的免疫学质控图类型、结果判断及失控的处理程序。熟练实验室确定人群中Cutoff值的主要方法本章要点返回总目录目录免疫学检验质量控制的概念1免疫检验质量控制的特殊性2免疫学实验常用评价指标3室内质量控制4室间质量评价5实验室质量控制数据的管理和信息系统6免疫学检验是临床检验中一大类重要的常规检查,对疾病的诊断、筛查、监测疾病的发展过程和观察患者对治疗的反应等方面发挥着重要的作用。如何保证检验结果的质量，在日常检测中如何贯彻实施质量保证是免疫学检验的一个重要内容。前言第一节免疫学检验质量控制的概念免疫检验要保证检验结果的准确、可靠、及时、有效，并尽可能使各实验室间检验结果有可比性，这是免疫学检验质量控制的基本目的。只有明确免疫学检验质量控制的有关概念，才能真正理解免疫检验的质量控制，有助于准确、有效地完成质量控制工作。一、基本概念准确度（accuracy）

待测物的测定值与其真值的一致性程度。精密度（precision）

一定条件下所获得的独立的测定结果之间的一致性程度。准确度好的实验，其精密度不一定好，反之亦然准确度好的实验，其精密度不一定好；准确度差的实验，其精密度则不一定差；反之亦然。

测定的精密度与准确度之间的关系偏倚（bias）

待测物的测定值与可接受参考值之间的差异。可分为批内偏倚和批间偏倚，计算公式如下：

均值（mean）

一组测定值中所有值的平均值。计算公式如下：

标准差（standarddeviation，SD或S）

又称标准偏差，用来表示一组测定数据的分布情况，即离散度。它是反映一组数据的精密度和离散程度的最主要指标。其计算公式如下：数据的分布情况。

变异系数（coefficientofvariation，CV）

标准差与平均值之比用百分比来表示，即为变异系数。CV是相对比，没有单位，更便于资料间的分析比较。误差（error）

待测物的测定值与客观存在的真值之间的差异。误差包括系统误差和随机误差。系统误差是实验过程中产生的误差，它的值恒定不变或遵循一定的变化规律，通常是由仪器、方法以及操作人员等因素引起。

随机误差则是一类不恒定的，随机变化的误差，主要是由实验人员的操作等随机因素所致，该误差的出现难以完全避免和控制。重复性条件（repeatabilityconditions）

在短的间隔时间内,在同一实验室对相同的测定项目使用同一仪器设备，由相同的操作者获得相互独立的测定结果的条件。批（run）在相同条件下所获得的一组测定。正态分布(gaussiandistribution)又称高斯分布，指当一质控物用同一方法在不同的时间重复多次测定，当测定数据足够多时，以横轴表示测定值，纵轴表示在大量测定中相应测定值的个数，则可得到一个两头低，中间高，中为所有测定值的均值，左右对称的“钟形”曲线，亦即正态分布。正态分布的基本统计学含义

可用均数（）、标准差（s）和概率来说明，均数是位于曲线的正中线所对应的值。正态分布是质量控制图的理论依据，也是许多统计方法的理论基础，正常情况下测量（或实验）误差服从正态分布。

二、质量保证的有关概念质量保证（qualityassurance，QA）致力于为某一产品或服务满足特定的质量要求，提供充分可信性所要求的有计划和系统的措施。最佳变异条件(optimalconditionsvariance，OCV)

是指在仪器、试剂和实验操作者等可能影响实验结果的因素均处于最佳时，连续测定同一浓度同一批号质控物20批次以上，即可得到一组质控数据，经计算可得到其均值()、标准差(s)和变异系数（CV），此CV即为OCV。常规条件变异(routineconditionsvariance，RCV)

是指在仪器、试剂和实验操作者等可能影响实验结果的因素均处于通常的实验条件下时，连续测定同一浓度同一批号质控物20批次以上，即可得到一组质控数据，经计算可得到其均值()、标准差(s)和变异系数（CV），此批间CV即为RCV。质控品（qualitytestingmaterisls）

又称质控物，是指含量已知并处于与实际标本相同的基质当中特性明确的物质，这种物质通常与其他杂质混在一起，故质控品必须按患者标本一样对待进行检测。

1、室内质控品：用于临床实验室标本检测误差的控制

2、室间质评样本：评价实验室常规测定的准确度

3、质控血清盘：用于特定的定性免疫测定试剂盒的评价第二节免疫检验质量控制的特殊性免疫学检验方法的种类较多，其测定方法的灵敏度和特异性要比生化方法高得多，因此进行质量控制的手段不能照搬生化模式。免疫检验质量控制包括定量、半定量和定性免疫检验三种类型。标准品（standard）

指含量明确的处于一定基质中其特性明确的物质，通常用于比较检测未知的物质或成分。标准品质量的优劣

直接影响样品的测定结果。一、标准品（一）标准品的概念和分类根据标准品性质的差异，可分为三级：一级标准品二级标准品

三级标准品为冻干品，内含载体蛋白，数量有限，可使用10~20年。通常为国际标准品，由WHO指定的实验室制备即国家标准品，是由国家的有关权威机构制备，供国家内部使用，其效价单位与国际标准品一致由二级标准品的比对而来的，通常由实验室自己或试剂生产厂家制备。

标准品IU/支建立的年份Mg/IU类风湿关节炎血清10019650.1710抗核抗体血清(均质型)10019700.1860人血清IgG、IgA、IgM10019700.1847人血清IgD10019710.8100人血清IgE1150019730.06562人AFP10000019750.001399人CEA10019750.0236FITC—绵羊抗人Ig10019760.0594FITC—绵羊抗人IgMμ链10019780.0447血清蛋白(白蛋白、α1-抗胰蛋白酶、C3铜蓝蛋白、转铁蛋白)10019781.1140人补体成分(C4、C5、Clq、B因子)10019801.1070FITC—绵羊抗人IgGγ链10019810.0923过氧化物酶标记绵羊抗人Ig10019820.0316抗RNP抗体-1983-平滑肌抗体-1983-线粒体抗体-1983-免疫学检验质控常用国际标准品（二）理想标准品的基本条件在规定保存条件下具有良好的稳定性通常为含蛋白质的缓冲液，对测定结果无明显影响。无已知传染危险性，对已知的血液传播病原体必须做灭活处理。标准品的基本条件标准品浓度在方法的测定范围即可。标准品浓度在方法的测定范围即可。定量免疫检验通常需要使用全自动免疫分析仪，在测定时须用校准品对仪器进行校准。室内质控则应选择特定试剂盒或方法的测定范围内的高、中和低三种浓度的质控品，以监测不同浓度标本测定结果的变化。二、定量、半定量和定性免疫检验（一）定量免疫检验半定量实验在免疫检验中比较少用，此类实验主要有酶免疫试验、荧光免疫试验等，测定结果通常以抗体的滴度、效价等表示。半定量免疫检验质控要点在于在有阴性质控的前提下，采用多个相应滴度或效价的抗体作为室内质控品，与临床标本同时测定。（二）半定量免疫检验定性免疫检验是免疫学检验的重点，其测定方法有很多，常以“有”或“无”也即“阳性”或“阴性”来表达测定结果。定性测定的室内质控要点是控制测定下限，设置临界cutoff值（CO值）的低值弱阳性质控物是定性室内质控的关键。应选择靶抗原或抗体浓度接近试剂盒或方法的测定下限的质控品进行室内质量控制，并与临床标本的测定同时进行，这一点对于使用肉眼判定测定结果的方法尤为重要（三）定性实验三、检测试剂的批间差异不同厂家

不同批号

产品的质量、技术含量的区别

原料来源、纯度不同以及生产条件变动利用可靠的定值血清对购入的试剂盒进行性能检测和批间差异评价，只有质量符合实验质量要求的试剂盒方可用于临床实际检测工作。地区储存、运输条件不同同一批号

引起试剂盒批间变异原因是多方面的：

1、试剂盒的原材料是依靠生物工程技术生产的，生产技术要求难度大，工艺提纯方法不好掌握，质量控制要求较高，产品质量不易稳定，使每批原材料的纯度和活性都有所差别；

2、用不同的提纯方法及不同批号的抗原或抗体所制备的试剂质量不一样；

3、同一批号的原料，不同组装工艺，其结果也不尽一样；

4、组装工艺相同，质量标准控制稍有欠缺，其结果也会有所差异。生产技术难度大

质量控制要求较高每批原材料的纯度和活性都有所差别

引起试剂盒批间变异原因是多方面的提纯方法不好掌握产品质量不易稳定四、检测试剂的稳定性稳定性是体外检测诊断试剂随时间推移保持特性一致性的能力，是试剂必须具有的基本属性，是确保体外检测诊断试剂使用过程中安全有效的重要指标。检测试剂的稳定性研究的类型一般分为保存期稳定性研究、使用期稳定性研究及运输模拟研究。保存期稳定性研究主要用于确定体外诊断试剂在规定的保存条件下最终包装内的有效期，一般至少使用3批产品建立保存期要求。使用期稳定性研究是指产品投入使用后产品保持活性的时间段，可以使用单一产品批号建立此类保存期要求。运输模拟研究是将样本暴露于预先设定的改变的环境条件下用于模拟产品在到达消费者前的过程中所能忍受的最坏的环境条件，此研究结果用于确定检测试剂最适宜的运输和保存条件，要求检测试剂至少有1个产品批号通过这种测试。目前欧盟有关体外检测诊断试剂的法规规定：对于长期稳定性研究，应采用3个批次产品；对于模拟运输条件下的稳定性研究，可采用1个批次产品；

对于延长保存期限的稳定性研究，应采用3个批次产品；对于可能影响稳定性的变更，可采用1个批次的产品。由于所用的仪器种类繁多，试剂盒品牌不一，实验室工作人员业务能力的差异等，造成不同实验室间的测定结果差异较大。临床免疫检验试剂盒保质期一般为6个月以上，有些检验机构为了节约成本，分数次使用试剂盒，势必会使酶标抗原处于溶解状态，影响试验结果。试剂盒抗体储存容器应由不吸附蛋白质的材料制成抗体浓度越高（浓度大于10mg/ml），越稳定，易保存；浓度低时，应加0.1%~1.5%的牛血清白蛋白作保护剂。酶标记抗体在应用防腐剂时要注意不能用NaN3。抗体浓缩液应在-20℃保存，避免反复冻融。36第三节免疫学实验常用评价指标临床上实验室免疫学检验的方法越来越多，如何对各种免疫学实验的进行对比，以评价各种检测方法的优劣，这需要通过一些有效的评价指标来鉴定。诊断敏感性（sensitivityofdiagnosis）

是指将实际患病者正确判断为真阳性的百分率，该指标值越大，则漏检的可能性愈小。一、诊断敏感性、特异性和正确诊断指数本指标可用于评价测定方法的临床应用价值，理想测定方法的诊断敏感性为100%。诊断特异性（specificityofdiagnosis）

是指将实际无病者正确判断为真阴性的百分率，该指标值越大，则误诊的可能性越小。本指标是用于评价测定方法的临床应用价值，理想测定方法的诊断特异性应为100%。正确诊断指数（Youdenindex）

又称约登指数，是指比较两个试验方法时，单独使用灵敏性或特异性，可能会出现一个实验方法的灵敏度高、特异性低；另一个试验方法的灵敏度低、特异性高，从而提出灵敏性和特异性之和减去1，大小范围从0到1

正确诊断指数愈大，实验的真实性亦愈好理想实验方法的正确诊断指数为1。诊断效率（efficiencyofdiagnosis）

诊断效率是指能准确区分患者和非患者的能力。理想测定方法的诊断效率应为100%。其计算公式为：

阳性预测值（positivepredictivevalue,PPV）

指特定试验方法测定得到的阳性结果中真阳性的比率。理想测定方法的阳性预测值应为100%，亦即没有假阳性。

阴性预示值（negativepredictivevalue,NPV）

指特定试验方法测定得到的阴性结果中真阴性的比率。理想测定方法的阴性预示值应为100%，亦即没有假阴性。Cutoff值即临界值，是指被检测分析物的量值，用于确定结果高于还是低于临床或分析的决断点。对于大多数免疫分析来说，来自感染和非感染人群的标本之间有一个检测结果的重叠区，这就说明一个实验方法一般不大可能有100%完全的敏感性、特异性或预测值。因此，在选则Cutoff值和报告检测结果时应该考虑哪个评价指标更重要

。选择Cutoff值和报告检测结果时应该考虑敏感性和特异性哪个更重要。理想的Cutoff值是实验室自己在的人群中确定。二、Cutoff值大多数免疫分析，来自感染和非感染人群的标本之间有一个检测结果的重叠区，即“灰区”通过阴性血清测定结果均值:使用阴性血清测定结果均值的2或3倍作为阳性判断值。使用正常人血清样本的均值和标准差:测定大量正常人血清样本，然后将所得到的吸光度均值增加2或3个SD作为阳性判断值。通过大量正常人血清样本和阳性血清样本:在测定大量正常人血清样本的同时，测定大量阳性血清样本，根据测定值为正态分布确定。通过测定转化型血清样本:在③的基础上加测转化型血清样本，取假阳性和假阴性发生率最低，且能区别抗原转化至抗体出现点的吸光度值作为阳性判断值。通过ROC曲线:ROC曲线上在患病率接近50%时，最接近左上角的那一点，可定为Cutoff值。Cutoff值的确定ROC曲线是以灵敏度为纵坐标，假阳性率（1-特异度）为横坐标绘制所得的曲线，又称受试者操作特性曲线。ROC曲线在Cutoff值中的应用应用

ROC曲线不仅可用于不同检验方法之间的比较，而且可用于对检验项目临床准确性的评价以及决定正常和异常的分界点（即Cutoff值）。意义

它表示灵敏度与特异度之间的相互关系，若在患病率接近50%时，最接近左上角的那一点，可定为Cutoff值，其假阳性率和假阴性率之和最小。第四节室内质量控制室内质量控制（internalqualitycontrol，IQC）

由实验室工作人员采取一定的方法和步骤，连续评价本实验室从收取样本至获得测定结果，并对结果进行分析的整个测定过程可靠性程度的措施。旨在监测和控制本室常规工作的精密度，提高本室常规工作中批内、批间样本检验的一致性，以确定测定结果是否可靠、可否发出报告的一项工作。一、室内质量控制系统的要求（一）确定分析方法可靠性

方法具有良好的特异性、灵敏性、稳定性。实用性检测快速、微量、技术要求不高、影响因素易控制。（二）建立标准化操作及流程免疫测定影响因素

试剂准备、加样、温育、洗板、显色和测定标准操作规程（SOP文件）仪器使用和维护、分析项目操作手册、质控品和标准品的使用、实验室工作流程。（三）仪器的校准和校准验证仪器、试剂盒和检测系统的测试和调整

校准检测程序和靶物质之间的关系使用校准品按照日常检测标本程序测定

验证仪器、试剂盒及检测系统的检测结果日常所用的器材的校准

温箱、水浴箱、冰箱、微量加样器、标准滴管等（四）标准品和质控品的使用标准品和质控品是保证质控工作的重要物质基础

建立质控标准，常规工作基础上评价检测结果的精密度和准确性

采用临界值血清，连续测定20次，作质控图

（五）保证试剂质量不同检测项目的试剂应严格要求使用国家药监局正式批准生产文号及卫生部“批批检”合格产品或同意进口的试剂盒

对所有的试剂品牌、规格、批号、效期作记录，以备质量评价。（六）实验室的环境、设施及设备充分的空间、良好的照明和空调设备

使实验室仪器设备保养良好，定期校准

1、极易出现问题的区域，如探针、洗涤区

2、洗板机注意加注洗液的探针孔堵塞问题及液体吸加的有效性

3、ELISA测定孔的非特异性显色问题等二、常用的免疫学统计质控图（一）室内质控规则的表达方式及定义质控规则的表达方式

质控规则以符号AL来表示，其中A为质控测定中超出质量控制限的测定值的个数，L为控制限，通常用或±1~3s来表示。当质控测定值超出控制限L时，即可将该批测定判定为失控。例如常用的l3s质控规则，其中l为原式中的A，3s为原式中的的L，其确切的含义为：在质控测定值中，如果有一个测定值超出±3s的范围，即可将该批次判定为失控。质控规则的符号及定义

符号定义l2s一个质控测定值超出±2s控制限时即失控l3s一个质控测定值超出±3s控制限时即失控22s两个连续的质控测定值同时超出+2s或-2s控制限时即失控R4s同一批测定中，两个不同浓度质控物的测定值之间的差值超出4s控制限时即失控31s三个连续的质控测定值同时超出+1s或-1s控制限时即失控41s四个连续的质控测定值同时超出+1s或-1s控制限时即失控7X七个连续的质控测定值同时处于均值的同一侧时即失控7T七个连续的质控测定值呈现一个向上或向下的趋势变化时即失控8X八个连续的质控测定值同时处于均值的同一侧时即失控9X九个连续的质控测定值同时处于均值的同一侧时即失控10X十个连续的质控测定值同时处于均值的同一侧时即失控（二）常用质控图的选择、绘制及结果判断Levey-Jennings质控图法基本特点是：

①根据均值（）和标准差（s）确定质控限，以±2s为告警限，

±3s为失控限判断质控结果②对待质控品应如同病人标本一样同等对待，不能进行特殊处理③当使用一个以上浓度的质控品想在同一张质控图描点时，则质控图上的和s可不标数据，而仅以和s表示；④若以±2s为失控限，假失控的概率太高，通常不能接受，以

±3s为失控限，假失控的概率低，但误差检出能力不强。

+3S+2S+1SX-1S-2S-3S测定批（次）01234567891011121314151617181920Levey-Jennings质控图Levey-Jennings质控图结合Westgard多规则质控方法该方法是将前述的多个质控规则同时应用进行质控判断的方法。常用的有6个质控规则，即12S、13s、22s、R4s、41s、10x,其中12S规则作为告警规则。通常上述规则中，13s和R4s规则反映的随机误差，而22s、41s和10x反映的是系统误差，系统误差超出一定的程度，也可从13s和R4s反映出来。符号意义判定标准12S一个质控测定值超出±2s质控限。发出警告，在控13S一个质控测定值超出±3s质控限。随机误差，失控22S两个连续质控测定值同时超出它们各自的+2s或－2s质控限。系统误差，失控R4S同一批内，两个不同浓度质控物的测定值之间的差值超出4s质控限。随机误差，失控41S四个连续的质控测定值同时超出+1s或－1s质控限。系统误差，失控10十个连续的质控测定值同时处于均值（）的同一侧。系统误差，失控Westgard多规则常用质控标准质控数据12S

在控可接受检测结果13S 22S R4S 41S 10X失控拒绝接受检测结果NONONONONOYESYESYESYESYESYESNOWestgard多规则质控标准逻辑图

“即刻法”质控法“即刻法”质控方法的实质是一种统计学方法，只要有连续3批质控测定值，即可对第3次测定结果进行质控。具体步骤是:

（1)将质控测定值从小到大排列，即x1、x2、x3、x4、x5、x6、……xn（x1为最小值，xn为最大值）；

（2)计算均值()和标准差(s)；

（3)按下述公式计算SI上限和SI下限值；

（4）将SI上限和SI下限值与SI值表中的数值比较。

“即刻法”质控SI值表nn3sn2snn3sn2s

31.151.1541.191.4651.751.6761.941.8272.101.9482.222.0392.322.11102.412.18112.482.23122.552.29132.612.33142.662.37152.712.41162.752.44172.792.47182.822.50192.852.53202.882.56质控结果的判断：1、SI上限和SI下限值均小于n2s对应的值时，测定值在2s之内，属“在控”。2、如SI上限和SI下限值中之一处于n2s和n3s对应的值之间时，测定值在2s～3s之间，处于“告警”状态。3、当SI上限和SI下限值之一＞n3s对应的值时，测定值的变化已超出3s，属“失控”。三、失控处理程序（一）常见的失控原因1.测定操作中的随机误差，如标本或试剂吸取的重复性差、试剂未混匀、洗涤不充分、温育时间和环境条件的一致性不佳等，或吸量不准；2.仪器故障或维护不良，如光路不洁、比色波长不对、管道堵塞等；3.试剂问题，如标准品和质控品不对、变质或失效，显色底物变质、试剂污染等；4.采用的质控规则和控制限范围不当等。（二）查找失控原因的步骤1.回顾整个试验过程，尽可能找到出问题的环节；2.如未找到原因，重测同一质控品，以排除人为误差和寻找偶然误差；3.如重测结果仍失控，打开一瓶新的质控品，重测失控项目，以排除质控品变质或过期；4.如检测结果仍不在控，进行仪器检查，如光源更换、比色杯清洗、仪器清洗或更换试剂等，维护后重测失控项目；5.更换新的校准液重新校准仪器，或更换操作人员，然后重测失控项目，以排除校准液的原因；6.如仍未找到原因，联系仪器或试剂生产厂家，进行技术支援。第五节室间质量评价

室间质量评价一般是由室间质量评价组织者定期发放一定数量的统一的质控样本给各参加质评实验室，然后实验室将测定结果在规定的时间内按照统一的格式报告至组织者进行统计学分析，最后由组织者向每一参加实验室寄发室间质评报告。室间质量评价（externalqualityassessment，EQA）

是指为客观地比较某一实验室的测定结果与靶值的差异，由外单位机构，采取一定的方法，连续、客观地评价实验室的结果，发现误差并校正结果，使各实验室之间的结果具有可比性。是对实验室操作和实验方法的回顾性价，是实验室质量改进的措施，而不是用来决定实时的测定结果的可接受性。一、质评的概念能力验证试验（proficiencytesting，PT）

是指利用实验室间检验来检查实验室检验能力的方法。目的是利用实验室间比对检验结果，检查实验室整体检验能力，评审各参与实验室的技术能力。

PT试验是为评审实验室时使用的一种评审方法，通过PT可提供该实验室具有得出可靠检验结果能力的主要证据。二、EQA和PT试验的区别及作用EQA是指进行实验室之间的比对试验，而PT试验是利用EQA的结果，评审实验室的技术能力。EQA的目的是多方面的，主要包括：评价实验室整体的检验能力；评价实验室工作人员的个人检验能力；确定检验方法的精密度；确定某一样品的准确度；PT的目的仅是评价实验室整体的检验能力。EQA根据其目的可分为自我教育和执业认可两大类，前者以英国国家室间质量评价计划NEQAs的EQA

为代表，后者则以美国CAP的PT试验为范本，二者的运作模式基本相同。我国逐步利用EQA的实验室能力评价结果对实验室质量保证、质量改进和实验室教育的措施，对发现实验中存在的问题、证明现行实验方法的有效性、评价实验室工作人员的能力方面有积极意义。三、EQA的方式、评分及意义发放质控品进行调查

国内外室间质评的最常用的形式临检中心--专业实验室--结果报中心—评价反馈实验室对质控物进行特殊对待，不能真实反映工作水平现场调查

事先不通知，临时派观察员到实验室容易发现实验室存在的实际问题，多用于专项调查或EQA成绩不合格的实地调查（一）EQA的方式（二）EQA的评分方法阴性或阳性型质评评分

1.计分主要用于定性测定室间质评，根据S/co判阴性或阳性：测定结果与预期结果相符，得2分测定结果与预期结果不符，得0分凡报可疑结果者得1分

2.评价

SI≥0为合格，成绩居于全国平均水平之上；

SI＜0为不合格，成绩居于全国平均水平之下。数字型质评评分

1.计分主要用于定量测定室间质评，直接以测定值计算SI：

2.评价

SI趋于0时，优秀，检测值接近全国预期值(靶值)。SI≤1时，优秀，测定值在全国检测分布的1S范围内。1＜SI≤2时，合格，在全国检测分布的1S外、2S之内范围。SI＞2时，不合格，说明测定存在较大的问题。（三）EQA的意义1.评价实验室是否具有开展相应检测项目的能力2.作为实验室外部措施，补充实验室内部的质量控制程序3.增加患者和临床医生对实验室能力的信任度4.通过EQA，质控物发放机构可进行项目方法学的评价第六节实验室质量控制数据的管理和信息系统1.随着计算机的发展及应用普及，临床实验室正逐步进入到计算机管理时代2.大量实验原始数据的保存，结果的推导计算，从标本接收、检测及结果报告各个环节的实验记录等等，均可通过计算机对这些数据进行统一管理。3.计算机管理的原始数据和记录应该建立一套有效的规章制度一、质量控制数据的管理二、信息系统在免疫质控管理中的应用实验室信息管