第二章 基因工程的酶学基础

基因工程《基因工程》第一章导论第二章基因工程的酶学基础第三章基因克隆的载体第四章基因工程的主要技术及其原理第五章目的基因的获得第六章大肠杆菌基因工程高效表达第二章基因工程的酶学基础第一节限制性核酸内切酶及其应用第二节DNA连接酶及其应用第三节DNA聚合酶及其应用第四节核酸酶第五节修饰性工具酶Geneticengineeringislargelyanexerciseincarefullycontrolledenzymology.Avarietyofenzymesformthebasictoolkitofthegeneticengineer.

1、限制性核酸内切酶的发现2、限制性核酸内切酶的分类合命名3、II型限制性核酸内切酶的基本特性4、限制性核酸内切酶的消化反应第一节限制性核酸内切酶及其应用50年代初发现了由寄主控制的限制和修饰现象(B)(K)大肠杆菌B大肠杆菌K114×10—

410—4E.O.P成斑率efficiencyofplatingK限制—修饰的酶学假说(B)(B)B酶切位点不被修饰噬菌体DNA被切割酶切位点被修饰Methylation基因组DNA不被切割1968年，Meselson和Yuan从大肠杆菌K和B中发现了I型限制性核酸内切酶；1970年，Smith和Wilcox从流感嗜血杆菌中分离纯化了第一个II型限制性核酸内切酶HindII，使得DNA分子的体外精确切割成为可能。1、限制性核酸内切酶的发现2、限制性核酸内切酶的分类合命名3、II型限制性核酸内切酶的基本特性4、限制性核酸内切酶的消化反应第一节限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶的概念

限制性核酸内切酶（Restrictionendonucleases）：是一类能够识别双链DNA分子中某种特定的核苷酸序列，并能精确特异地切割双链DNA分子的核酸内切酶。已经从近300中微生物中分离出了500余种限制性核酸内切酶。限制性核酸内切酶的分类1.限制修饰活性2.内切酶的蛋白质结构3.限制辅助因子4.切割位点5.特异性切割6.基因克隆中I型单一多功能的酶3种不同亚基ATP、Mg2+和S-腺苷甲硫氨酸距特异性位点1000bp不是无用II型限制酶和修饰酶分开单一成分Mg2+特异性位点及其附近是非常有用III型双功能酶2种亚基ATP、Mg2+和S-腺苷甲硫氨酸特异性位点3‘端24-26bp处是有用限制性核酸内切酶的命名属名种名株名HindIII

HindIIIHaemophilusinfluenzae

d嗜血流感杆菌d株同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶1、限制性核酸内切酶的发现2、限制性核酸内切酶的分类合命名3、II型限制性核酸内切酶的基本特性4、限制性核酸内切酶的消化反应第一节限制性核酸内切酶2、识别序列的对称性识别双链DNA分子中4-8对碱基的特定序列大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧识别切割序列呈典型的旋转对称型回文结构5‘…GCTGAATTCGAG…3’3‘…CGACTTAAGCTC…5’EcoRI的识别序列EcoRI的切割位点II型限制性核酸内切酶的3大特点1、识别位点的特异性

每种酶都有其特定的DNA识别位点，通常是由4、5、6或7个核苷酸组成的特定序列（靶序列）。

回文序列中的单链可形成发卡结构双链回文序列可形成十字架结构3、切割位点的规范性

双链DNA被酶切后，分布在两条链上的切割位点旋转对称（可形成粘性末端或平末端的DNA分子）。粘性末端

cohesive

ends因酶切位点在两条DNA单链上不同（对称）酶切后形成的具有互补碱基的单链末端结构，酶切产生的两个粘性末端很

容易通过互补碱基的配对而重新连接起来。平末端

Bluntend因酶切位点在两条DNA单链上相同，酶切后形成的平齐的末端结构，这种末端不易重新连接起来。同裂酶

isoschizomers能识别和切割同样的核苷酸靶序列的不同内切酶。同尾酶

isocaudamers识别的靶序列不同，但能产生相同粘性末端的一类限制性核酸内切酶。注意：由同尾酶产生的粘性末端序列很容易重新连接，但是两种同尾酶消化产生的粘性末端重新连接形成的新片段将不能被该两种酶的任一种所识别。与II型核酸内切酶有关的几个概念几种II型限制性核酸内切酶的酶切位点PstIProvindenciastuartii164

CTGCAGGACGTCHaemophilusinfluenzaeRd

EcoRI等产生的5‘粘性末端5‘…G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C…5’EcoRI37℃5‘…G-C-T-G-OH

P-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-P

OH-G-C-T-C…5’退火4-7℃5‘…G-C-T-G

A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A

G-C-T-C…5’OHPOHP

经同尾酶消化的DNA末端连接示意图5’XXXXGGATCCXXXXXX3’3’XXXXCCTAGGXXXXXX5’BamHI5’XXXXGGATCCXXXXXX3’3’XXXXCCTAGGXXXXXX5’5’XXXXAGATCTXXXXXX3’3’XXXXTCTAGAXXXXXX5’BglII5’XXXXA

GATCTXXXXXX3’3’XXXXTCTAG

AXXXXXX5’5’XXXXAGATCCXXXXXX3’3’XXXXTCTAGGXXXXXX5’5’XXXXAGATCCXXXXXX3’3’XXXXTCTAGGXXXXXX5’BamHIBglII1、限制性核酸内切酶的发现2、限制性核酸内切酶的分类合命名3、II型限制性核酸内切酶的基本特性4、限制性核酸内切酶的消化反应第一节限制性核酸内切酶

一个酶单位（U）指：在理想的反应条件（适宜的缓冲液和反应温度，通常为37℃）下，50L反应体系中完全降解1gDNA所需要的酶量。影响酶活性的因素很多，最重要的有：A。DNA的纯度和甲基化程度B。甘油的含量（不超过5%）C。反应体系中的离子强度D。反应体系的pH值F。反应的温度条件（通常为37℃

）酶单位的定义和影响酶活性的因素Buffer(10X)2.0LWater16.5LDNA1.0LEnzyme0.5LVolume20.0L

酶切反应的基本步骤＋－电泳紫外分析37℃1h加反应液CKMBuffer(10X)2.0LWater16.5LDNA1.0LEnzyme0.5LVolume20.0L

1.0kb1.0kb0.4kb0.5kb0.6kbCKMTT第二章基因操作的工具酶第一节限制性核酸内切酶及其应用第二节DNA连接酶及其应用第三节DNA聚合酶及其应用第四节修饰性工具酶Geneticengineeringislargelyanexerciseincarefullycontrolledenzymology.Avarietyofenzymesformthebasictoolkitofthegeneticengineer.1、DNA连接酶作用的特点2、DNA连接酶的反应条件3、DNA连接的策略第二节DNA连接酶及其应用DNA连接酶的发现

环形DNA分子的发现使科学家相信一定有一种能连接这种Nick的酶存在。

1967年，世界上几个实验室几乎同时发现了一种能够催化在2条

DNA链之间形成磷酸二酯键的酶——DNA连接酶（ligase）。DNA连接酶由大肠杆菌基因组DNA编码，以NAD+作为能源辅助因子；T4DNA连接酶由大肠杆菌T4噬菌体DNA编码，以ATP作为能源辅助因子。（1970年）容易制备，而且可以连接完全配对的平末端DNA分子，所以在基因克隆中应用广泛。NickNickDNA连接酶作用的特点A.连接的两条链必须分别具有3′端自由羟基（-OH）和5′端磷酸基团（-P），而且只有这两个基团彼此相邻时才能进行连接反应；B.在羟基和磷酸基团间形成磷酸二酯键是一种耗能过程，因此连接反应必须有能量分子的参与，通常有两种能量分子，即ATP和NAD+。OKNODNA连接酶DNA连接酶的基本性质连接多个平头双链DNA分子：5‘…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G

…3’3‘…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C

…5’5‘…G-C-T-C-A-G-OH

P-C-T-G-G-A-G

…3’3‘…C-G-A-G-T-C-P

OH-G-A-C-C-T-C

…5’T4-DNA连接酶1、DNA连接酶作用的机理2、DNA连接酶的反应条件3、DNA连接的策略第二节DNA连接酶及其应用DNA连接反应的条件

连接反应最佳温度为37℃，但是此时粘性末端间氢键结合不够稳定，而且酶活性也会迅速降低。比如，EcoRI粘性末端连接部位只有4个碱基对，很容易断开。所以通常在4-15℃连接。影响连接效率的因素有：A.温度（最主要的因素）B.ATP的浓度(10M-1M)C.连接酶浓度（平末端较粘性末端要求高）D.反应时间（通常连接过夜）E.插入片段和载体片段的摩尔比转化4℃过夜加反应液CK-重组菌落CK+1、DNA连接酶作用的机理2、DNA连接酶的反应条件3、DNA连接的策略第二节DNA连接酶及其应用粘性末端DNA片段的连接NickNick平末端DNA片段的末端加尾连接法3’3’5’5’3’3’5’5’末端核苷酸转移酶+dATP+dTTP3’3’5’5’3’3’5’5’AAAAATTTTDNA聚合酶和T4DNA连接酶平末端DNA片段加接头连接法

衔接物(linker)，也叫接头，是有人工化学合成的一段10-12个核苷酸的DNA双链，其中包含有1个或几个限制性酶切位点。使用时只须将衔接物和目的片段的5′端用多核苷酸激酶处理使之磷酸化，然后用T4DNA连接酶进行连接，就可获得能产生粘性末端的DNA片段。CCGAATTCGGGGCTTAAGCC磷酸化CCGAATTCGGGGCTTAAGCCPOHOHPPPOHOHT4连接酶CCGAATTCGGGGCTTAAGCCPOHPOHEcoRICCGAATTCGGGGCTTAAGCCAATTCGGGCCCCGGGCTTAA第二章基因操作的工具酶第一节限制性核酸内切酶及其应用第二节DNA连接酶及其应用第三节DNA聚合酶及其应用第四节修饰性工具酶Geneticengineeringislargelyanexerciseincarefullycontrolledenzymology.Avarietyofenzymesformthebasictoolkitofthegeneticengineer.1、大肠杆菌DNA聚合酶I2、Klenow片段3、T4DNA聚合酶4、逆转录酶（反转录酶）第三节DNA聚合酶及其应用

大肠杆菌DNA聚合酶I

（E。ColiDNApolI）是KornbergA.1956年首先从大肠杆菌E。Coli细胞中分离出来的。它是一种多功能性的酶，包括3种不同的酶活力：5′-3′聚合酶活性以双链DNA为模板，催化单核苷酸结合到引物的3′末端，并不断延伸。5′-3′外切酶活性将双链DNA中游离的5′末端逐个切去。3′-5′外切酶活性将游离的双链或单链DNA的3′端降解。不过对于双链的降解可被5′-3′的多聚活性所抑制。CCGGGCTATCGGACCGGGCTATCGGAPolI+Mg2+ATAGCCTCCGATAGCCTGGCTATCGGACCGATAGCCTGGCTACCGATAGCCTGGCTATCGGAPolI+Mg2+CCGATAGCCTGGCTAPolI+Mg2+T

大肠杆菌DNA聚合酶I的三种用途A.制备高比活度的DNA探针

利用其5′--3′的外切酶活性及其聚合酶活性。B.用于DNA连接后的大缺口填充

利用5′--3′的聚合酶活性。C.用于DNA的序列分析

利用5′--3′的聚合酶活性。

大肠杆菌聚合酶I的应用示例CCGATAGCCTGGCTATCGGACCGATAGCCTGGCTATCGGAPolI+Mg2+缺口转移(Nicktranslation)CCGGGCTATCGGACCGGGCTATCGGAPolI+Mg2+ATAGCCT1、大肠杆菌DNA聚合酶I2、Klenow片段3、T4DNA聚合酶4、逆转录酶（反转录酶）第三节DNA聚合酶及其应用

Klenow片段的主要用途Klenow片段大肠杆菌聚合酶I全酶经枯草杆菌蛋白酶处理获得N端三分之二的大肽段，它仍然有5′→3′的聚合酶活性和3′→5′的核酸外切酶活性，但失去了5′→3′的外切酶活性。Klenow片段的主要用途修补限制性酶消化DNA形成的3′隐蔽末端同位素标记DNA片段的末端cDNA克隆中第二链cDNA的合成双脱氧末端终止法测定DNA序列GAACTTAADNA聚合酶大肠杆菌DNA聚合酶I大片段（Klenow）Klenow酶的基本用途：补平由核酸内切酶产生的5‘粘性末端5‘…G-C-T-G-OH

P-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-P

OH-G-C-T-C…5’KlenowdATPdTTP5‘…G-C-T-G-A-A-T-T-OH

P-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-P

OH-T-T-A-A-G-C-T-C…5’DNA聚合酶大肠杆菌DNA聚合酶I大片段（Klenow）Klenow酶的基本用途：DNA片段的同位素末端标记5‘…G-C-T-G-OH

P-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-P

OH-G-C-T-C…5’Klenowa-32P-pppdAdTTP5‘…G-C-T-G-A-A-T-T-OH

P-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-P

OH-T-T-A-A-G-C-T-C…5’1、大肠杆菌DNA聚合酶I2、Klenow片段3、T4DNA聚合酶4、逆转录酶（反转录酶）第三节DNA聚合酶及其应用

T4DNA聚合酶的特点T4DNA聚合酶是

从T4噬菌体感染了的大肠杆菌中分离出来的，它和Klenow片段一样具有5′→3′的聚合酶活性和3′→5′的核酸外切酶活性。其外切酶活性要比大肠杆菌聚合酶I的活性高200倍.T4-DNA酶的基本特性：1

5‘→3‘的DNA聚合酶活性和3‘→5‘的核酸外切酶活性2在无dNTP时，可以从任何3‘-OH端外切3在只有一种dNTP时，外切至互补核苷酸暴露时停止4在四种dNTP均存在时，聚合活性占主导地位

T4DNA聚合酶的用途1、以取代反应标记延伸末端或平头末端的双链DNA片段2、切平由核酸内切酶产生的3’粘性末端3、

DNA片段的同位素末端标记T4DNA聚合酶活力—取代反应：如果反应体系中仅存在一种dNTP，这时T4DNA聚合酶就会表现出3′→5′外切酶活力，从双链DNA的3′开始降解，直到露出和缺乏的那中dNTP互补的碱基，然后就在此位置发生合成和取代反应。CGTCGCGCAGCGCGTGCAGCGdTTPMg++CGGCAGCGdTTPMg++T4-DNA聚合酶的基本用途：切平由核酸内切酶产生的3’粘性末端5‘…G-C-T-C-T-G-C-A-OH

P-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-P

HO-A-C-G-T-C-C-T-C…5’T4-DNA聚合酶5‘…G-C-T-C-OH

P-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-P

HO-C-C-T-C…5’注意：该酶也能降解双链DNA，只是其活性比单链降解活性低很多T4-DNA聚合酶的基本用途：DNA片段的同位素末端标记5‘G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T3’3‘C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A5‘Mg2+5‘pppdN5‘pppdA（a-32P-dATP）5‘G-C-T-CA-G-C-T-G-OHHO-T-C-G-A-C-C-T-C-A5‘T4-DNApolT4-DNApol5‘G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T3’3‘C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A5‘1、大肠杆菌DNA聚合酶I2、Klenow片段3、T4DNA聚合酶4、逆转录酶（反转录酶）第三节DNA聚合酶及其应用

逆转录酶—Reversetranscriptase逆转录酶是

一种可以有效地将mRNA转录成为DNA的酶，其产物称为cDNA(complementaryDNA).实际上，它也是一种RNA依赖的DNA聚合酶。逆转录酶首先是1970年从鼠白血病毒和劳氏肉瘤病毒中发现的。这两个课题组的论文都发在了同一期的《Nature》杂志上。主要用途是

将mRNA转录成cDNA以制备基因片段。3’AAAAAAAAAAAAAAAA5’TTTTTTTTTAAAAAAAATTTTTTTTT5’TTTTTTTTT3’AAAAAAAA

第二章基因操作的工具酶第一节限制性核酸内切酶及其应用第二节DNA连接酶及其应用第三节DNA聚合酶及其应用第四节修饰性工具酶Geneticengineeringislargelyanexerciseincarefullycontrolledenzymology.Avarietyofenzymesformthebasictoolkitofthegeneticengineer.1、末端转移酶（terminaltransferase）2、核酸酶SI（SInuclease）4、碱性磷酸化酶第四节修饰性工具酶末端转移酶的特性末端转移酶是一类不依赖于DNA模板的DNA聚合酶。末端脱氧核苷酰转移酶（TdT）来自小牛胸腺该类酶可以在没有模板链存在的情况下，随机掺入dNTPs，将核苷酸连接到DNA的在3‘羟基，特别是对于平末端的双链DNA末端加尾十分有效。最常见的用途是在酶切产生的平末端加尾以便于创造粘性的互补末端。平末端DNA片段的末端加尾连接法3’3’5’5’3’3’5’5’末端核苷酸转移酶+dATP+dTTP3’3’5’5’3’3’5’5’AAAAATTTTDNA聚合酶和T4DNA连接酶1、末端转移酶（terminaltransferase）2、核酸酶SI（SInuclease）3、碱性磷酸化酶（Alkalinephosphatase）第四节修饰性工具酶核酸酶单链核酸内切酶：S1核酸酶S1核酸酶的基本反应：内切带缺口或缺刻的双链DNA或RNA5‘…G-C-T-C-A-GC-T-G-G-A-G-T…3’3‘…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A…5‘5‘…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T…3’3‘…C-G-A-G-T-C

A-C-C-T-C-A…5‘nickgapS1Zn2+5‘…G-C-T-C-A-G3‘…C-G-A-G-T-CT-G-G-A-G-T…3’A-C-C-T-C-A…5‘3’AAAAAAAAAAAAAAAA5’TTTTTTTTTAAAAAAAATTTTTTTTT5’TTTTTTTTT3’AAAAAAAA

发夹结构的切除TTAAAATT单链尾巴的切除1、末端转移酶（terminaltra