激光扫描共聚焦显微镜dabian

LaserScanningConfocalMicroscopy激光扫描共聚焦显微镜一、简介激光扫描共聚焦显微镜是上世纪八十年代发展起来的一项具有划时代意义的高科技产品。激光扫描共聚焦显微镜是当今世界上最先进的分子细胞生物学分析仪器。它是在荧光显微镜成像基础上加装了激光扫描装置,利用计算机进行图像处理,使用紫外或可见光激发荧光探针,从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图像,在亚细胞水平上观察生理信号及细胞形态的变化,成为形态学、分子生物学等领域中新一代强有力的研究工具。激光扫描共聚焦显微镜在材料科学、地质科学等工业工程方面也有着广泛应用。激光扫描共聚焦显微镜利用激光扫描束经照明针孔形成点光源对标本内焦平面上的每一点扫描，标本上的被照射点，在探测针孔处成像，有探测针孔后的光电倍增管（PMT）或冷电感耦合器件（cCCD）逐点或逐线接收，迅速在计算机监视屏幕上形成荧光图像。照明针孔与探测针孔相对于物镜焦平面是共轭的，焦平面上的点同时聚焦于照明针孔和探测针孔，焦平面以外的点不会在探测针孔处成像，这样得到的共聚焦图像是标本的光学横断面。在显微镜的载物台上加上一个微量步进马达，可使载物台上下步进移动，最小步进距离现在已达到10nm，则细胞或组织各个横断面的图像都能清楚的显示，实现了光学切片的目的。FluorescentMicroscopeObjectiveArcLampEmissionFilterExcitationDiaphragmOcularExcitationFilterObjectiveLaserPinholeExcitationPinholePMTEmissionFilterExcitationFilterConfocalMicroscope荧光显微镜的缺点:1.无法实现对荧光,透射光的同时采集,无法实现多荧光的同时采集2.荧光散射光太强，造成实际分辨率的大大下降。3.荧光漂白很快，使荧光图像的拍照有困难。4.无法对样品进行断层扫描,完成3D的工作.5.对于信号较弱的样本,无法提高观察的灵敏度.6.可以观查活细胞或组织但细胞或组织内结构高度重叠ConfocalvsNonconfocalSpatialresolutionAxialresolution高分辨率的扫描,强大的ZOOM功能,精细的观察高分辨率的扫描,强大的ZOOM功能,精细的观察药物缓释观察时间分辨和快速扫描动态图像出色的反射光图像明场，DIC,相差和透射光图像

单标，双标和三标图像

激光共聚焦显微成像技术的应用二、基本结构:激光光源(根据用户要求选装四种波长）扫描装置（X,Y,Z,t扫描方式自由组合）显微镜（物镜放大倍数10至100）检测器（独立的四个检测器，可同时测量）计算机控制系统：包括数据采集、处理、转换及相应应用软件图像输出设备及光学装置（如光学滤片，分光器，共聚焦针孔及相应的控制系统）结构示意图激光共聚焦显微镜的应用单、双、三,四色标记检测。精确的一、二、三、四维观察。高品质的荧光成像、透射成像、物体表面反射成像。静态和动态观察(Ca2+,pH,膜电位,膜流动性等)。定性以及定量分析。光谱扫描,ROI扫描.特殊的光反应(FREP,FRAP,CAGED-UNCAGED等)。

一.定位、定量免疫荧光标记（单标、双标或三标）的定位、定量如：细胞膜受体或抗原的分布，微丝、微管的分布、两种或三种蛋白的共存与共定位、蛋白与细胞器的共定位、干细胞的分化细胞凋亡:AnnexinV-fitc+PI

末端原位杂交-fitc+PI荧光原位杂交：染色体基因定位单细胞凝胶电泳GFP的表达活细胞或活体组织静息游离Ca2+

的分布与定量活细胞内pH的定量、膜电位的测量活细胞内自由基水平的定量Helagreen-中心体red-纺锤体

Immuno-fluorecencelabel定位、定量研究中常用荧光探针1.Amine-ReactiveProbes

与抗体耦联、与配体耦联、与肽耦联、与人工合成的寡聚核苷酸耦联的探针，可用于免疫组化、荧光原位杂交、受体标记等FITC异硫氰基荧光素(四甲基异硫氰基罗丹明)494/518TRITC544/572Cy5650/690AlexaFluor488488/530PE(藻红蛋白)565/578TexasRed(德州红)595/615Cy3490/530BODIPYFL503/512BODIPYTMR543/569BODIPYTR592/6181)细胞表面抗原、胞内某种蛋白

免役荧光标记：与抗体耦联,直标:一抗+荧光探针间标:二抗+荧光探针如:微管蛋白(抗tublin抗体+荧光探针)肌动蛋白(Palloidine+荧光探针)2)细胞膜表面受体

配体+荧光探针如:nAchR、mAchR、多巴胺受体(D1,D2)

标记Gm1:霍乱毒素受体霍乱毒素+FITC

2.标记细胞器荧光探针1)线粒体Mitochondria

Rodamin123505/534，可染活细胞，阳离子性,可检测线粒体膜电位,且在多数细胞中停留时间短

JC1线粒体膜电位低时为单体490/527发绿光线粒体膜电位高时为多聚体490/590发红光可标记活细胞线粒体，且为检测线粒体膜电位最佳探针MitotrackerGreenFM490/516,染活细胞或固定细胞,稳定不漏出MitotrackerOrangeCMTMRos551/576,(氧化型)MitotrackerOrange还原型,只能染活细胞2)溶酶体Lysosome

中性红541/640:微偏碱性,可标记溶酶体等酸性器官

为非特异性

AO:LysoTrackerGreenDND-26504/511,染活细胞

LysoTrackerBlueLysoTrackerRed3)内质网EndoplasmicReticulum

DiOC6484/500:非特异性,较高浓度标记内质网,较低浓度标记线粒体4)高尔基体GolgiapparatusNBDC6-ceramie466/536,可染活或死细胞

5)细胞核

PIpropidiumiodide536/617DNA/\RNA死细胞碘化丙啶EBethidiumbromide518/617DNA/RNA死细胞Hochest33342352/461DNAA-T活细胞Hochest33258(同上)DAPI358/461DNAA-T半通透细胞ChromomycinA3450/470DNAG-CAO500/526DNA活细胞460/650RNATOTO-1514/533DNA 死细胞SYTO11~1620~24488/520活细胞SYTO11~1620~24521/556活细胞SYTO17 621/634 活细胞3.GFP绿色荧光蛋白GFP的的发现：60年代，Shimomura等首先从水母中分离出一种水母发光蛋白(aequoren)，该蛋白与钙和肠腔素结合后可产生蓝色荧光。然而水母整体几提取的颗粒都呈绿色，后经证实在水母体内还存在另外一种发光蛋白即绿色荧光蛋白GFP,

后经研究表明，在水母体内Ca2+和肠腔素与水母发光蛋白结合后，水母发光蛋白产生蓝色荧光，GFP在蓝光的激发下，产生绿色荧光。

将外源基因与GFPDNA相连,GFP可作为外源基因的报告基因实时监测外源基因的表达GFP主要应用:

对活细胞中的蛋白质进行准确定位及动态观察如:可实时原位跟踪特定蛋白在细胞生长、分裂、分化过程中的时空表达

GFP基因与分泌蛋白基因连接后转染细胞,可动态观察该分泌蛋白分泌到细胞外的过程

GFP基因与定位于某一细胞器特殊蛋白基因相连,转染后，就能显示活细胞中细胞核、内质网、高尔基体、线粒体、胞内体等细胞器的结构，用于定位标志。可用于双标记或三标记4.量子点（QuantumDots）"Thedevelopmentofsemiconductornanocrystalsforbiologicallabelinggivesbiologistsanentirenewclassoffluorescentprobesforwhichnosmallorganicmoleculeequivalentexists,"theauthorsoftheSciencepaperwrote."Thesenanocrystalprobescanbecomplementaryandinsomecasesmaybesuperiortoexistingfluorophores."comparedwithconventionalfluorophores,semiconductornanocrystalshavea"narrow,tunable,symmetricemissionspectrum,andarephotochemicallystable."

Science

281,2013-2016(1998).

二.光学切片和三维重组光学切片和三维重组:LSCM通过薄层光学切片功能，可获得标本真正意义上的三维数据，经计算机图像处理及三维重建软件，产生生动逼真的三维效果，可进行形态学观察，并揭示亚细胞结构的空间关系，用以阐明三维结构与组织功能之间的关系。

3Dreconstruction

三.动态测量Physiology:细胞内离子动态变化测量1)游离Ca2+测量

检测游离Ca2+变化荧光探针的原理：这类探针多为Ca2+螯合剂，不与Ca2+结合时不发荧光，通常也不能进入细胞膜，只有与乙酰甲酯AM相连方可进入细胞内，被细胞内酯酶水解后并与胞内游离钙结合后发出荧光。Kd值为Ca2+解离常数，表明检测Ca2+浓度的范围:0.1xKd-10xkd,Kd和很多因素有关，如pH、Mg2+、与蛋白的结合、温度等。细胞内生理Ca2+浓度值(10-100nM)，细胞内Ca2+超载浓度值（基础Ca2+浓度的10倍左右）

荧光探针激发波长 发射波长KdFLuo3-AM,K+,dextran506nm 525nm390nMFluo4 506nm525nm CalciumGreen-1507nm 530nm190nMCalciumGreen-2507nm 535nm550nMFurared 420/480nm 637nm140nMOregonGreen488 494n520nm 20,000nMCalciumCrimson 583nm 602nm328nMIndo-1 356nm405/458nm230nMFura-2 340/380nm476nm145nM

细胞内游离Ca2+测量的应用钙的特性1．细胞内外的电化学梯度103-104倍2．细胞膜渗透性稍有改变或钙库释放稍有增加，导致胞内钙明显升高3．细胞内钙为细胞激活“开关”细胞内钙的生理作用1．肌肉的兴奋收缩-收缩偶联2．神经递质的释放3．学习记忆的增强4．卵子受精5．细胞分裂和再生6．细胞调亡7．细胞间通讯8．细胞信号传导9.DNA合成10.基因表达2）pH值的检测：

BCECF-AM 490nm530nm6.5-7.5Snarf-1-AM488nm580/640nm7.0-8.03）自由基的检测荧光探针：H2DCF-DA2-氢，2氯荧光素乙酰乙酸盐（504nm/529nm）

胞外H2DCF-DA------扩散入细胞内-----酯酶脱乙酰----DCF-H(不发光）------DCF（发光）*样品不能在镜下用汞灯照射

Dihydrorhodamine123（507nm/529nm）H2rhod123----被动扩散入细胞内----在细胞内被氧化成rod123（发光）四.细胞膜电位的测量标记膜电位探针(慢反应）：JC1510nm 530/590nmDioc5(3)548nm 573nmDioc6(3)484nm 500nm快反应探针：Di-4-ANEPPS496nm 703nmDi-4-ANEPPS498nm 713nm细胞膜静息膜电位：-70mV线粒体膜电位：-150mV以上均属于阳离子探针，更容易与线粒体亲和，为线粒体膜电位探针

质膜流动性测定:

细胞膜荧光探针受到极性光线激发后，其发射光极性依赖于荧光分子的旋转，而这种有序的运动自由度依赖于荧光分子周围的膜流动性。膜的磷脂酸组成分析；药物效应和作用位点；温度反应测定及物种比较等。五.笼锁解笼锁的测量

NBD-Ca2+NBD-IP3NBDNBD+Ca2+IP3紫外光光活化技术

许多重要的生物活性物质和化合物（如神经递质、细胞内第二信使、核苷酸、Ca2+及某些荧光素等）均可形成笼锁化合物。当处于笼锁状态时，其功能被封闭；一旦被特定波长的瞬间光照射，则因光活化而解笼锁，其原有活性和功能得以恢复，从而在细胞增殖、分化等生物代谢过程中发挥作用。肌肉生理；钙和膜电位对神经递质释放的调节作用；钙振荡的机制；微管和微丝的动力学。六．荧光能量共振转移(fluorescenceResonanceEnergyTransfer)能量转移：能量从分子的一个部位向另一个部位的传递，或能量从一个分子向另一个分子传递。能量的提供者叫能量供体，能量的接受者叫能量受体。荧光能量共振转移的条件两个荧光分子：供体-FL1，受体-FL2供体与受体的距离在2-7nm供体的发射波长与受体的激发波长一致荧光共振能量转移（FRET）技术

FRET是一个无辐射、量子级能量转移现象，指的是当一个荧光分子（供体）受到激发时，能量像邻近的另一荧光基团（受体）转移的过程。两个荧光基团的距离可以通过FRET的效率来计算。荧光共振能量转移（FRET）技术

生物大分子结构和功能研究免疫分析核酸杂交分析蛋白质间相互作用研究r:分子间距离R0:分子间发生50%能量转移的距离

DAr>2R0Dr<2R0A检测

以FL1的激发波长的光照射样品，没有共振转移时，只检测到FL1的发射光(绿光)，发生共振转移时，就可检测出

FL1的荧光(绿光)减弱，FL2(红光)的增强。应用：检测大分子的相互作用大分子构象的改变(蛋白)例：大分子(亚基)的结合与分离受体与配体的结合

常用荧光探剂：FITC/TRITC,Cy3/Cy5,BFP/GFP

生物学意义上的共定位（Co-localization），是指两个或多个分子完全处于同一空间位置上。这些分子一般是指蛋白，可以用荧光抗体或探针加以检测。七.位置相关性

八材料科学研究Zaslavskaiaet.al,MartekBiosciences,MD,June15,2001November

2001;Volume128(21):pp4301-4314.Courtesy:Jose-EduardoGomes,UniversityofOregon,USANature,25April2002,pg854.

激光扫描共聚焦显微镜现在在世界许多研究机构成为常规仪器。

细菌学生物化学细胞生物学组织胚胎学食品科学遗传学药理学生理学神经科学植物学病理学材料科学四、应用研究方向:生物化学和生物电化学纳米材料的组装和生物标记生物芯片检测纳米药物单分子检测（一）、生物化学和生物电化学激光扫描共聚焦显微镜被广泛应用于细胞和分子生物学研究的各个领域，只要拥有相应的荧光探针，经合理的设计，LSCM可用于对任何细胞结构（生物膜、细胞器、染色体等）及分子（核酸、蛋白、脂类）、离子（Ca2+、K+、H+等）进行定位、定量、实时、动态的观测，同时还可测定分子扩散、膜电位、氧化——还原状态和配体结合等生化反应变化程度。LSCM具有将形态学观察、生理学动态监测和三维图像分析融为一体的“细胞CT”功能，可进行细胞膜流动性，细胞间通讯的测定研究。利用LSCM技术，可以研究生物传感器和生物大分子之间的作用（包括DNA分子相互作用、生物酶与DNA相互作用、蛋白分子相互作用、自组装单分子膜等等）。

（一）、生物化学和生物电化学激光扫描共聚焦显微镜被广泛应用于细胞和分子生物学研究的各个领域，只要拥有相应的荧光探针，经合理的设计，LSCM可用于对任何细胞结构（生物膜、细胞器、染色体等）及分子（核酸、蛋白、脂类）、离子（Ca2+、K+、H+等）进行定位、定量、实时、动态的观测，同时还可测定分子扩散、膜电位、氧化——还原状态和配体结合等生化反应变化程度。LSCM具有将形态学观察、生理学动态监测和三维图像分析融为一体的“细胞CT”功能，可进行细胞膜流动性，细胞间通讯的测定研究。利用LSCM技术，可以研究生物传感器和生物大分子之间的作用（包括DNA分子相互作用、生物酶与DNA相互作用、蛋白分子相互作用、自组装单分子膜等等）