第三章 细胞生物学研究方法

第三章细胞生物学研究方法细胞形态结构的观察方法

细胞组分的分析方法

细胞培养、细胞工程复习纲要第一节细胞形态结构的观察方法

1.光学显微镜技术（lightmicroscopy）

2.电子显微镜技术(Electromicroscopy)

第二节细胞组分的分析方法

1.离心分离技术

2.细胞内核酸、蛋白质、酶、糖与脂类等的显示方法

3.特异蛋白抗原的定位与定性

4.细胞内特异核酸的定位与定性

5.定量细胞化学分析技术第三节细胞培养、细胞工程细胞培养

细胞工程1.光学显微镜技术（lightmicroscopy)1.1普通复式光学显微镜技术1.2荧光显微镜技术（FluorescenceMicroscopy）1.3激光扫描共聚焦显微镜技术（LaserConfocalMicroscopy）1.4相差显微镜（phase-contrastmicroscope）1.5微分干涉差显微镜1.6倒置显微镜

倒置显微镜组成和普通显微镜一样，只不过物镜与照明系统颠倒，前者在载物台之下，后者在载物台之上，用于观察培养的活细胞，具有相差物镜。微分干涉显微镜(DIC)优点：能显示结构的三维立体投影影像。与相差显微镜相比，其标本可略厚一点，折射率差别更大，故影像的立体感更强。

用途：DIC显微镜使细胞的结构，特别是一些较大的细胞器，如核、线粒体等，立体感特别强，适合于显微操作。目前像基因注入、核移植、转基因等的显微操作常在这种显微镜下进行。微分干涉显微镜(DIC)计算机辅助的微分干涉显微镜可以得到很高的反差，其分辨率比普通光镜提高了一个数量级，这不仅填充了普通光镜与电镜之间分辨率的间隙，也为高分辨率下研究活细胞提供了必要工具。2.电子显微镜技术

2.1透射电子显微镜的基本知识2.1.1电镜与光镜的比较2.1.2电镜与光镜光路图比较2.1.3电子显微镜的基本构造

2.1.4主要电镜制样技术超薄切片技术负染色技术冰冻蚀刻技术2.2扫描电子显微镜（Scanningelectronmicroscope，SEM）

扫描电子显微镜作用：用来观察标本的表面结构。工作原理：用一束极细的电子束扫描样品，在样品表面激发出次级电子，次级电子由探测体收集，并被转变为光信号，再经光电倍增管和放大器转变为电信号来控制荧光屏上电子束的强度，显示出与电子束同步的扫描图像。图像为立体形象，反映了标本的表面结构。为了使标本表面发射出次级电子，标本在固定、脱水后，要喷涂上一层重金属微粒，重金属在电子束的轰击下发出次级电子信号。

冰冻蚀刻技术冰冻蚀刻（freeze-etching）也称冰冻断裂（freeze-fracture）标本置于-100˚C的干冰或-196˚C的液氮中，进行冰冻,然后用冷刀骤然将标本断开，升温后，冰在真空条件下迅即升华，暴露出断面结构，称为蚀刻（etching）。蚀刻后，向断面以45度角喷涂一层蒸汽铂，再以90度角喷涂一层碳，加强反差和强度。然后用次氯酸钠溶液消化样品，把碳和铂的膜剥下来，此膜即为复膜（replica）。复膜显示出了标本蚀刻面的形态，在电镜下得到的影像即代表标本中细胞断裂面处的结构。负染色技术负染就是用重金属盐（如磷钨酸、醋酸双氧铀）对铺展在载网上的样品进行染色；吸去染料，样品干燥后，样品凹陷处铺了一薄层重金属盐，而凸的出地方则没有染料沉积，从而出现负染效果，分辨力可达1.5nm左右超薄切片技术通常以锇酸和戊二醛固定样品，以环氧树脂包埋，以热膨胀或螺旋推进的方式推进样品切片厚20~50nm普通复式光学显微镜技术

分辨率是指区分开两个质点间的最小距离N=介质折射率；α=镜口角，λ=入射光波长荧光显微镜技术（FluorescenceMicroscopy）1.2.1原理：高压汞灯，激发滤片，阻断滤片

直接荧光标记技术

免疫荧光标记技术（间接标记）1.2.2应用

在光镜水平用于蛋白质、核酸等生物大分子的定性定位：

如绿色荧光蛋白(GFP)的应用

绿色荧光蛋白GFP是一个分子量较小的蛋白，易与其他一些目的基因产物形成融合蛋白，且不影响目的基因产物的空间构象和功能。GFP与目的基因融合，将目的基因产物标记为绿色，可定量分析目的基因的表达水平，显示其在细胞内的表达位置和量的变化，为探讨该基因在细胞中的作用及其分子机制提供便利条件。

/view/957211.htm尼康E800荧光DIC显微镜荧光显微镜照片（微管呈绿色、微丝红色、核蓝色）1.3激光扫描共聚焦显微镜技术

（LaserScanningConfocalMicroscopy）1.3.1原理:物镜与聚光镜聚焦于同一点上，排除焦平面以外光的干扰，增强 图像反差和提高分辨率(1.4—1.7倍)，可重构样品的三维结构。1.3.2应用：可以用于观察细胞形态，也可以用于细胞内生化成分的定量分析、光密度统计以及细胞形态的测量。

激光扫描共聚焦显微境

LCSM照片，蓝色为细胞核，绿色为微管原理：将相位差转换成振幅差，从而提高各种结构间的对比度。结构：环状光澜，相差物镜用途：可用于观察活细胞

相差显微镜电镜与光镜的比较

显微镜分辨本领光源透镜真空成像原理LMTEM200nm100nm0.1nm可见光（400-700）紫外光（约200nm)电子束（0.01-0.9）玻璃透镜玻璃透镜电磁透镜不要求真空不要求真空要求真空1.33x10-5～1.33x10-3Pa利用样品对光的吸收形成明暗反差和颜色变化利用样品对电子的散射和透射形成明暗反差电镜与光镜光路图比较电子显微镜的基本构造2.3扫描电镜原理与应用：电子“探针”扫描，激发样品表面放出二次电子，探测器收集二次电子成象。CO2临界点干燥法可以消除引起样品变形的表面张力问题1.离心分离技术

1.1用途：于分离细胞器与生物大分子及其复合物1.2种类:

差速离心：在密度均一的介质中由低速到高速逐级离心，用于分离不同大小的细胞和细胞器.

密度梯度离心：用一定的介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，通过重力或离心力场的作用使细胞分层、分离，常用的介质为氯化铯，蔗糖和多聚蔗糖。2.细胞内核酸、蛋白质、

酶、糖与脂类等的显示方法

原理：利用一些显色剂与所检测物质中一些 特殊基团特异性结合的特征，通过显色剂在细胞中的定位及颜色的深浅来判断某种物质在细胞中的分布和含量。

3.特异蛋白抗原的定位与定性

（免疫细胞化学）定义：根据免疫学原理，利用抗体同特定抗原专一结合，对抗原进行定位测定的技术。分为直接免疫荧光鱼间接免疫荧光

。3.1免疫荧光技术： 快速、灵敏、有特异性，但其分辨率有限（图）

3.2免疫电镜技术：免疫铁蛋白技术免疫酶标技术免疫胶体金技术

应用：通过对分泌蛋白的定位，可以确定某种蛋白的分泌动态；胞内酶的研究；膜蛋白的定位与骨架蛋白的定位等直接免疫荧光鱼间接免疫荧光4.细胞内特异核酸的定位与定性

（原位分子杂交技术）用来检测染色体上的特殊DNA序列。最初是使用带放射性的DNA探针，通过放射自显影来显示位置。后来又发明了免疫探针法，将探针核苷酸的侧链加以改造，探针杂交后，其侧链可被带有荧光标记的抗体所识别，从而显示出位置。4.1光镜水平的原位杂交技术

探针用同位素标记或荧光素标记

4.2电镜水平的原位杂交技术

探针用生物素标记,检测用与抗生物素抗体相连的胶体金标记显示

免疫探针法人类染色体端粒DNA的荧光原位杂交照片5.定量细胞化学分析技术5.1

细胞显微分光光度术（Microspectrophotometry）利用细胞内某些物质对特异光谱的吸收，测定这些物质 （如核酸与蛋白质等）在细胞内的含量。5.2流式细胞仪（FlowCytometry）：流式细胞术是对单个细胞进行快速定量分析与分选的一门技术。用于定量测定细胞中的DNA、RNA或某一特异蛋白的含量；测定细胞群体中不同时相细胞的数量；从细胞群体中分离某些特异染色的细胞；分离DNA含量不同的中期染色体。

1.细胞培养

活细胞离体后要在一定的生理条件下才能存活和进行生理活动，特别是高等动植物细胞要求的生存条件极其严格，稍有不适就要死亡。所以细胞培养技术（cellculture）就是选用最佳生存条件对活细胞进行培养和研究的技术。动物细胞的生存环境与植物细胞差别很大，因而二者的培养方法很不相同。1.1动物细胞培养1.2植物细胞培养1.3非细胞体系（cell-freesystem）1.2植物细胞培养1.2.1组织培养：诱发产生愈伤组织，如果条件适宜，可培养出再生植株。用于研究植物的生长发育、分化和遗传变异；进行无性繁殖；制取代谢产物。1.2.2悬浮细胞培养：在愈伤组织培养技术基础上发展起来的一种培养技术。适合于进行产业化大规模细胞培养，制取植物代谢产物。1.2.3原生质体培养：脱壁后的植物细胞称为原生质体（protoplast），其特点是：①比较容易摄取外来的遗传物质，如DNA；②便于进行细胞融合，形成杂交细胞；③与完整细胞一样具有全能性，仍可产生细胞壁，经诱导分化成完整植株：1.2.4单倍体培养：通过花药或花粉培养可获得单倍体植株，经人为加倍后可得到完全纯合的个体。植物细胞培养1.1动物细胞培养（一）培养方式大致可分为两种：1.1.1群体培养（massculture），将含有一定数量细胞的悬液置于培养瓶中，让细胞贴壁生长，汇合（confluence）后形成均匀的单细胞层；1.1.2克隆培养（clonalculture），将高度稀释的游离细胞悬液加入培养瓶中，各个细胞贴壁后，彼此距离较远，经过生长增殖每一个细胞形成一个细胞集落，称为克隆（clone）。1.1动物细胞培养（二）

原代培养（primaryculture）：从动物机体取出的进行培养的细胞群。原代培养的细胞生长比较缓慢，而且繁殖一定的代数后（一般10代以内）停止生长，需要重新更换培养基。将细胞从一个培养瓶转移到另外一个培养瓶即称为传代或传代培养（Passage）。

细胞株（cellstrain）：从原代培养细胞群中筛选出的具有特定性质或标志的细胞群，能够繁殖50代左右，在培养过程中其特征始终保持。细胞系（cellline）：从肿瘤组织培养建立的细胞群或培养过程中发生突变或转化的细胞，在培养条件下可无限繁殖克隆（clone）：亦称无性繁殖系或简称无性系。对细胞来说，克隆是指由同一个祖先细胞通过有丝分裂产生的遗传性状一致的细胞群。群体培养（左）和克隆培养（右）2.细胞工程即细胞水平的生物工程,使用的主要技术有细胞培养、定向诱导分化、细胞融合和显微注射等。2.1细胞融合（cellfusion）技术2.2单克隆抗体（monocloneantibody）技术2.3显微操作技术

细胞融合通过培养和诱导，两个或多个细胞合并成一个双核或多核细胞的过程称为细胞融合（cellfusion）或细胞杂交（cellhybridization）。基因型相同的细胞融合成的杂交细胞称为同核体，来自不同基因型的杂交细胞则称为异核体。诱导细胞融合的方法有三种：生物方法（病毒）、化学方法（聚乙二醇PEG）、物理方法（电激和激光）。某些病毒如：仙台病毒、副流感病毒和新城鸡瘟病毒的被膜中有融合蛋白（fusionprotein），可介导病毒同宿主细胞融合，也可介导细胞与细胞的融合，因此可以用紫外线灭活的此类病毒诱导细胞融合。化学和物理方法可造成膜脂分子排列的改变，去掉作用因素之后，质膜恢复原有的有序结构，在恢复过程中便可诱导相接触的细胞发生融合。LightPathwayofMicroscopeDAPI染色显示的前中期染色体明视场与相差的观察效果比较DIC显微镜下的硅藻冰冻蚀刻电镜照片