液相色谱应用案例2

液相色谱应用案例（二）廖杰liaojie301@163.com液相色谱应用案例在药物研究开发中的应用质量研究药物代谢在生物标志物研究与分析中的应用DHPLC与基因诊断体液中氨基酸分析体液中儿茶酚胺的测定其它应用蛋白质组研究中的色谱预分离药物研究开发过程中的液相色谱靶标鉴定/确认生物标志物的分离/鉴定药物发现药物开发临床研究生产销售药物设计/合成/鉴定/筛选/毒性评价确定候选药物原料和制剂的临床前研究药学/药理毒理纯化/鉴定代谢组学研究确证结构/质量研究/制定质量标准/稳定性研究/动物体内药代申报检验疗效和毒性质量控制疗效/毒性长期研究人体药代/长期稳定性研究/临床用药的质量控制QA/QC批准上市疾病研究20年抗放药物研究的基本情况———————————————————————

研究项目数量(X)(Xx100)/7000x%———————————————————————————

在小鼠上试验过的化合物7000100.0

对小鼠有抗放作用的化合物>2303.3

在狗上试验过的化合物>701.0

对狗有效的化合物>300.43

能上人进行研究的化合物140.2

临床上进行扩大研究的药物40.057———————————————————————应用实例：新型COX-2抑制剂的研制COX抑制剂NSAIDsCOX（环氧化酶）COX-1COX-2PGs合成调节外周血管阻力保护胃肠道粘膜调节血小板聚集PGs合成促进炎症反应和组织损伤COX-2抑制剂AA→PGs化合物设计系列化合物合成化合物纯化/鉴定活性筛选，确定候选药物质量研究，制定质量标准影响因素试验，加速试验药效学实验稳定性考察药理毒理实验制剂研究毒性实验药代动力学研究临床前申报批准后进行I期、II期和III期临床试验毒性评价建立HPLC分析方法——确定应用目的纯度检查/质量控制（鉴别/有关物质检查/含量测定）/代谢研究分离对象——原料/制剂/体液/组织定量分析/定性分析常量/痕量主成分/相关杂质常规质控/实验室研究建立HPLC分析方法——了解中间体和副产物合成路线（略）建立HPLC分析方法——初步建立方法选择色谱分离条件

确定检测波长254nm

色谱图（略）建立HPLC分析方法——方法优化与验证有关物质检查检测波长的确定面积归一化法/自身对照法（<0.5%）系统适用性试验——理论塔板数、主峰与相邻杂质的分离度供试品溶液的稳定性方法验证——专属性、精密度、最低检出限色谱图（略）主成分及相邻杂质的MS1图（略）主要杂质的LC-离子阱质谱鉴定主成分及相邻杂质的MS2图谱（略）建立HPLC分析方法——方法优化与验证原料与制剂的含量测定确定定量方法/含量限度系统适用性试验——理论塔板数、主峰与相邻杂质的分离度供试品溶液的稳定性方法验证——专属性、线性、精密度、回收率、耐用性各三批供试品测定批号￥￥￥片剂的溶出曲线建立HPLC分析方法——方法优化/验证/实施片剂溶出度的测定专属性精密度线性回收率方法的耐用性与UV法比较建立HPLC分析方法——方法优化与验证强酸破坏强碱破坏氧化剂破坏原料和制剂稳定性研究高温/高湿/光照试验加速试验长期留样品色谱图（略）建立HPLC分析方法

——动物体内代谢的研究选择内标化合物预处理方法的确定建立色谱分离和检测方法分析方法的确证与实施主要代谢产物的鉴定血浆药物浓度测定方法——内标的选择内标的选择：结构类似；非内源性物质；稳定性好目标化合物及内标的结构式（略）血浆药物浓度测定方法——预处理方法血浆药物浓度测定方法——分离检测方法12色谱条件（略）荧光检测紫外检测ABCABC方法的专属性——内源性物质、代谢产物不干扰分离线性——……定量限——……日内和日间精密度——三个浓度（……

）准确度稳定性——血浆室温放置24hr、-20℃和室温反复冻融血浆药物浓度测定方法——方法的确证日期截距（×10-3）斜率(×10-3)相关系数r2005-5-238.426.360.99882005-6-4-1.417.290.99832005-7-2511.876.630.99812005-8-1614.267.020.99762005-8-1911.608.290.99632005-8-2023.847.610.9991血浆药物浓度测定方法——实际样品测定每一分析批建立一条标准曲线，同时携带QC样品，分散在整个待测样品分析过程的前、中、后进行测定，以保证每个分析批的准确性比格犬口服片剂颗粒血浆药物浓度随时间的变化血浆药物浓度测定方法——实际样品测定体内代谢转化研究——代谢物分离色谱图（略）样品前处理：……体内代谢转化研究——代谢物制备色谱条件：……1234色谱图（略）体内代谢转化研究——代谢物鉴定ESI-MSn分析条件：电喷雾离子源（ESI），正离子方式检测，喷射电压6KV；毛细管温度250℃；毛细管电压21V；管透镜补偿电压55V；碰撞气为He；鞘气（N2）流速为25流量单位（a.u.）；辅助气（N2）流速为35流量单位（a.u.）；注射泵进样速度5L·min-1；采集范围：m/z50~800。M1M2M4化学结构（略）BiomarkerAnalysis蛋白质组研究中的色谱预分离蛋白质组(proteome=protein

+

genome):

一种细胞、组织或生物体完整基因组所对应的全套蛋白质蛋白质组学proteomics——研究细胞内全部蛋白质的组成及其活动规律的科学对照样品疾病样品疾病特异蛋白图象处理蛋白质分析蛋白质切割酶切质谱数据库检索疾病相关蛋白质组研究流程图溶液或胶上酶切溶液酶切全溶液酶切蛋白质提取液超声破碎、离心SDS-PGGE多肽混合物胶上酶切cLC-MS/MS2DE胶上酶切多肽混合物MSorcLC-MS/MS2DLC多肽混合物细胞、组织或体液cLC-MS/MSorMUPIT多肽混合物cLC-MS/MSorMUPITHPLC/ALIEFSDS/RPLCcLC-MS/MSorMUPIT生物信息学分析

蛋白质组研究技术路线流程图LoadingPump1or2EnrichmentColumnsWasteNanoLCPumpInjectorNanoboreColumnIonTrapanalysisSCXColumnSaltasgradientorsteps01020304050607080Time[min]20mMHCOONH440mMHCOONH460mMHCOONH480mMHCOONH4100mMHCOONH4150mMHCOONH4250mMHCOONH4CapillaryornanoLCPumpInjectorSCXColumnSaltgradientCollectedfractionsLoadingPumpInjector1or2EnrichmentColumnsWasteNanoLCPumpNanoboreColumnIonTrapanalysis1990’s2000FutureGene

DiscoveryDiscovery

of

VariationsVariationLinkage

toDiseaseDiagnostics

and

PharmacogeneticsDHPLC与基因诊断SubstitutionsACCGTCAAC...GCGACCTTGGCAGTTG…CGCTGGTACCGTCCAC...GCGACCTTGGCAGGTG…CGCTGGTTransversion:exchangeofapurineforapyrimidineA->CPurine->PyrimidineInsertions5’ACCGTCAACGACCT3’3’TGGCAGTTGCTGGT5’TCGGATAGCCTA5’ACCGTTCGGATCAACGACCT3’3’TGGCAAGCCTAGTTGCTGGT5’Deletions5’ACCGTCAAC...GCGACCT3’3’TGGCAGTTG…CGCTGGT5’5’ACCGTCAACGACCT3’3’TGGCAGTTGCTGGT5’C…GG…CDHPLC分离原理DHPLC的分离模式Nondenaturing:50C

(SizeDependent,SequenceIndependent)

High-Resolution

dsDNAFragmentSeparations

bp587458434298257+26717410280Partiallydenaturing:52-78C

(SizeandSequenceDependent)

dsDNAMutationDetectionbydHPLCPartiallydenaturing:52-78C

(SizeandSequenceDependent)

SNPDetectionEightdifferentpolymorphismsincludingadeletion,insertionandahomozygouschangeinoneamplicon.Heterozygous

7(SNP)Heterozygous

6(SNP)Heterozygous

5(1bpinsertion)Heterozygous

4(SNP)Heterozygous

3(1bpdeletion)Heterozygous

2(SNP)Heterozygous

1(SNP)WildtypemixedwithhomozygousmutantWild

type体液中氨基酸分析体液中游离氨基酸水平反映了机体的营养和代谢状态，氨基酸的水平及改变，与某些疾病，如肝病、肝性脑病、肾病，以及某些先天性、代谢性疾病有关。特别是必需氨基酸与非必需氨基酸比值、支链氨基酸与芳香氨基酸比值的测定，在临床上具有一定的诊断和判断预后的意义。TheAminoAcidsCode氨基酸分析方法柱后衍生离子交换色谱-茚三酮-570nm/440nm柱前衍生衍生-反相色谱-荧光检测或UV检测色谱柱：WatersNovPakODS柱（3.9mmx150mm）及保护柱流动相：A0.05mol/L醋酸盐缓冲液，pH6.8，含8%乙腈；B乙腈梯度洗脱荧光检测：激发波长335nm，发射波长455nm样品前处理：血浆—加入内标（磺基同型半胱氨酸）—沉淀蛋白—衍生化血浆同型半胱氨酸

血浆中游离Hcy大约占总量的<2%以下。Hcy值可以作为一种疾病预警指标，即血液中同型半胱氨酸含量升高，标志着动脉粥样硬化的发生，是动脉血栓形成的独立危险因子。尿中三甲基组氨酸

3-甲基组氨酸是骨骼肌肌动蛋白和肌球蛋白的降解产物，测定尿中3-甲基组氨酸的排泄量，有助于了解肌组织收缩蛋白的降解情况，从而掌握肌肉所承受的运动负荷。色谱柱：Shim-ODS(4.6mmx250mm)柱，5μｍHypersil-C18流动相：A四氢呋喃：甲醇：磷酸盐缓冲液5：95：900；B甲醇，梯度洗脱荧光检测：激发波长260nm，发射波长455nm样品前处理：收集尿液—加入内标（乙醇胺）—衍生化LC/MS/MS用于氨基酸代谢紊乱的筛查PKU——一种常见的遗传性氨基酸代谢疾病，因患者体内缺乏苯丙氨酸羟化酶，苯丙氨酸不能正常代谢。中国PKU的发病率是1：11180MSUD——一种染色体隐性遗传性疾病，缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸这三种支链氨基酸的代谢受阻，导致BCAA及其衍生物α-酮酸在体内聚积，对脑组织产生神经毒性作用。体液中儿茶酚胺的测定内源性生物胺，由肾上腺髓质嗜铬细胞中β-羟化酶催化合成，同时受多种酶活性的影响尿——原发性高血压/嗜铬细胞瘤血浆——帕金森病、心脏病、神经脊瘤、甲亢脑脊液——研究生物胺在神经系统的生理病理条件的作用样品前处理：血浆—加入内标（3，4-二羟基苄胺）—过氧化铝柱提取—沉淀蛋白色谱柱：

Hypersil-C184.6mmx250mm，5μｍ流动相：0.1mmol/L磷酸二氢钠水溶液（含辛烷磺酸钠0.85mmol/L，0.5mmol/LEDTANa2）：甲醇89：11（用磷酸调pH至3.25）电化学检测：工作电压+0.85mV1去甲肾上腺素2肾上腺素3DHBA4多巴胺

血浆中儿茶酚胺最低检出限：E:0.25ng；NE:0.3ng；DA:0.20ng样品前处理：血浆—加入内标（3，4-二羟基苄胺）—过氧化铝柱提取—沉淀蛋白色谱柱：

Hypersil-C184.6mmx250mm，5μｍ流动相：0.1mmol/L磷酸二氢钠水溶液（含辛烷磺酸钠0.85mmol/L，0.5mmol/LEDTANa2）：甲醇89：11（用磷酸调pH至3.25）电化学检测：工作电压+0.85mV1去甲肾上腺素2肾上腺素3DHBA4多巴胺

血浆中儿茶酚胺最低检出限：E:0.25ng；NE:0.3ng；DA:0.20ng样品前处理：尿液（稀释/过滤）—加入内标（5-羟基吲哚-乙酰胺）—衍生化色谱柱：

Cosmosil5C18

4.6mmx250mm，5μｍ流动相：乙腈：10mmol/L醋酸缓冲液（pH6.0）35：65荧光检测：λex345nm，λem480nm15-羟基吲哚胺2肾上腺素35-羟吲哚45-羟色胺5内标尿中儿茶酚胺(荧光衍生化)最低检出限：肾上腺素5.6fmol去甲肾上腺素4.8fmol5-羟色胺18.0fmol组织中腺嘌呤核苷酸的测定样品前处理：组织—液氮冻结—高氯酸冰浴匀浆—调pH色谱柱：

ZorbaxSB-C184.6mmx150mm，5μｍ流动相：50mmol/L磷酸盐缓冲液（pH5.8）/甲醇：76/24（含离子对试剂A5mmol/L）紫外检测：259nm腺嘌呤核苷酸（ATP、ADP、AMP）是生物