植物病理学研究方法第6章第2节

植物病理学基础研究方法

（第6章第2节)分子生物学技术在植物病原物鉴定、检测中的应用2/5/2023

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1第二节分子生物学技术在植物病原物鉴定、检测中的应用分子生物学技术已经应用于一切生物学领域。在植物病理学研究中已应用于植物病原物的鉴定、检测，抗病基因的克隆以及抗病转基因植物的培育中。本节中主要学习应用PCR及相关技术进行植物病原物的鉴定、检测等问题。2/5/2023

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2第二节分子生物学技术在植物病原物鉴定、检测中的应用一.PCR（聚合酶链反应）技术（一）PCR的原理（二）PCR技术的操作（三）PCR技术的发展（四）PCR技术在植物病理学中的应用二.RAPD方法与SCAR标记三.RFLP和AFLP技术四.核酸序列分析2/5/2023

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3一.PCR（聚合酶链反应）技术PCR（polymerasechainreaction）技术，即“聚合酶链反应”，是体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法，由美国科学家Mullis于1983～1985年发明。该技术模拟发生于生物细胞内的DNA复制过程，无需繁琐的基因克隆程序便可在数小时内获得大量拷贝的特异DNA片段，其步骤简便，结果可靠，为研究和分析基因提供了一种全新的方法，被誉为分子生物学技术上的一场革命，在生物学各个领域都得到广泛的应用。Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。2/5/2023

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4（一）PCR的原理PCR的原理与体内DNA复制的过程相似，它模拟DNA聚合酶在生物体内的催化作用，在体外进行特异DNA序列的聚合和扩增。2/5/2023

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5生物体内DNA分子的结构和复制2/5/2023

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6DNA的结构2/5/2023

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7DNA的结构:4种脱氧核苷酸组成ATGCATGC氢键磷酸二酯键3‵-OH3‵-OH3‵-OH使dNTP依次连接磷酸脱氧核糖2/5/2023

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8DNA复制的方向：新链只能从5’端´→3’端´5’端和3’端：磷酸基团的末端称为5’端。DNA的核糖的羟基末端称为3’端。3‵-OH使dNTP依次聚合2/5/2023

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9DNA复制的酶学底物:dNTP

即dTTP

dATP

dCTP

dGTP酶:DNA聚合酶(polymerase),

拓扑异构酶,解螺旋酶,引物酶,DNA连接酶(ligase)。模板(template):解开成单链的DNA母链引物(primer):

提供3‵-OH使dNTP依次聚合。蛋白因子：单链结合蛋白(SSB)。

众所周知，ＤＮＡ是由四种碱基按互补配对原则（即腺嘌呤Ａ对胸腺嘧啶Ｔ，鸟嘌呤Ｇ对胞嘧啶Ｃ）组成的螺旋双链。在细胞内，ＤＮＡ复制时，解螺旋酶首先解开双链让它变成单链做为模板，然后，引物酶合成一小段引物结合到ＤＮＡ模板上，最后，DNA聚合酶以这段引物为起点，合成与ＤＮＡ模板配对的新链。2/5/2023

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DNA复制的起始就是要解开双链和生成引物。(一)DNA解成单链 由拓扑异构酶松弛超螺旋，解螺旋酶解开双链，SSB结合到单链上使其稳定。

生物体内DNA分子的结构和复制2/5/2023

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(二)引物合成引发体引导引物酶到达适当的位置合成引物。引物长度约为十几个到几十个核苷酸不等。引物的合成方向也是5´→3´方向。2/5/2023

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(三)延伸(elongation)：

复制体延DNA移动，dNTP依次聚合。2/5/2023

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13生物体外DNA分子的复制

——PCR技术

2/5/2023

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14PCR的3个基本反应ＰＣＲ即是在体外模拟ＤＮＡ复制的过程，它用加热的办法让所研究的ＤＮＡ片段变性变成两条单链，人工合成两个引物让它们结合到ＤＮＡ模板的两端，ＤＮＡ聚合酶即可以大量复制该模板。PCR是由3个基本反应:

变性、退火、延伸

3步反应周期反复循环。每循环一次所产生的DNA均能成为下一次循环的模板。20次PCR循环将产生约一百万倍(220)的扩增产物。2/5/2023

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15变性（双链DNA解链成单链）1.变性：将反应体系置高温下(91～94℃,1min),DNA双螺旋的氢键断裂(变性)，形成单链DNA。模板DNA、引物1、引物2、dNTP和TaqDNA聚合酶、Mg2+、Buffer

模板DNA：含有待扩增区域的DNA

特异性引物:与模板DNA待扩增区域两端已知序列互补的寡核苷酸

dNTP：带有A、T、G、C的单核苷酸（脱氧核苷三磷酸）

TaqDNA聚合酶：催化DNA复制的酶

Mg2+:保证DNA复制的酶活性

Buffer：缓冲液2/5/2023

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16退火（按碱基配对原则结合形成双链区）2.退火：使温度下降

(37～65℃,1min)，PCR反应体系中的引物与模板链3’端互补区退火（按碱基配对原则结合形成局部双链区），引物与模板结合。由于DNA聚合酶需要有一小段双链DNA来启动（引导）新链的合成（在生物体内也如此），于是，TaqDNA聚合酶将单核苷酸从引物的3′端引入，催化磷酸二脂键生成。引物的关键作用有二：①启动新链的合成；②引物的退火位点决定新DNA链的起点。2/5/2023

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17延伸（DNA合成链的延伸）3.延伸；72℃，2min,在适当的缓冲液中，Mg2+存在条件下，Taq

DNA聚合酶按模板的碱基顺序不断引入4种dNTP（脱氧核苷三磷酸）合成互补链，按5′→3′的方向不断延伸。由于两引物都是按与扩增区段两端序列彼此互补的原则设计的，在每一条新合成的DNA链上都具有新的引物结合位点。2/5/2023

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18从退火

到延伸有人问：退火时为什么引物与模板杂交，而模板双链不复性呢？原因：一是相对模板DNA来说引物的量大；二是模板DNA比引物分子量大且复杂。所以在复性时，引物与模板在局部形成杂交链的机会比模板复性要大得多。引物1引物1引物2引物22/5/2023

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19PCR扩增过程2/5/2023

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201234522557294时间（min）温度（℃）适温延伸3高温变性1低温退火2重复1~3步25~30轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性DNA变性形成2条单链子链延伸DNA加倍PCR扩增过程2/5/2023

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21PCR仪——基因体外扩增仪；热循环仪

2/5/2023

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22（二）PCR技术的操作冰上向管中依次加入下列试剂：

总体积

25µl

10×Buffer2.5µl

MgCl22mmol/L

dNTP

0.2mol/L（4种dNTP各1/4）

引物

0.2µmol/L

模板

10ng

Taq酶

2µL

双蒸水补至终体积2/5/2023

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23微量移液器的使用方法

1)吸进液体时按到第一档，垂直进入液面几毫米。缓慢松开控制按钮，防止液体进入吸头过速会导致液体倒吸人移液器内部吸入体积减少。2)打出液体时贴壁并有一定角度，先按到第一档，稍微停顿1s后，待剩余液体聚集后，再按到第二档将剩余液体全部压出。2/5/2023

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24反应循环参数反应管放入PCR仪中，按如下程序操作：

94℃预变性

2～5min94℃变性

1min

45～62℃退火

1min72℃延伸

2min

循环30次

72℃延伸

7min

（以保证扩增出来的片段都是全长的）循环结束后反应产物置于4℃保存2/5/2023

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25PCR条件的优化：在PCR反应中主要影响因素有：模板、Mg2+

、三磷酸脱氧核苷酸（dNTP）、引物、TaqDNA聚合酶、温度循环参数。2/5/2023

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26⑴模板量模板的纯度及量对反应有重要的影响。一般含量在2～100ng均能获得目标产物。模板的量过少可能PCR产物在琼脂糖凝胶电泳中不能被检测出来；模板量太大也会影响PCR的效率，并且会出现非特异产物。模板可用总DNA，一般不需高度纯化，甚至煮沸细胞释放出DNA也可作模板。2/5/2023

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27⑵Mg2+浓度Mg2+是TaqDNA聚合酶活性所必需的。不同的引物-模板系统，最适合的Mg2+浓度可能不同。

Mg2+浓度过低，酶活力显著降低；浓度过高催化非特异扩增。通常适合的Mg2+为0.5～5.0mmol/L，需做预备实验来选定。2/5/2023

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28⑶dNTP浓度反应中每种dNTP的终浓度为20～200µmol/L时，PCR产物量、特异性与合成忠实性间的平衡最佳。适宜dNTP浓度可根据靶序列长度和碱基组成来确定。2/5/2023

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29⑷引物浓度一般PCR体系中引物的终浓度为0.2～0.5µmol/L，在此范围内，PCR产物量基本相同。但引物量低于0.2µmol/L时，PCR产物量降低；引物量过高会促使非特异产物的合成，还会增加引物二聚体的形成。2/5/2023

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30⑸退火温度退火温度直接影响扩增的特异性，退火温度高则扩增特异性高，但PCR产物量低；退火温度过低易导致非特异性扩增。需进行预备实验选择适宜退火温度。2/5/2023

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31⑹TaqDNA聚合酶浓度在其它参数最佳时，100µL反应液含1～2.5µL

TaqDNA聚合酶为佳。如果酶浓度太高易出现非特异扩增带；酶浓度过低时，则靶序列产量很低。

2/5/2023

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32热启动可提高特异性、扩增效率采用热启动可提高特异性，还可提高扩增效率。方法为：反应体系的最后1种成分（如TaqDNA聚合酶）暂不加入，加热到80℃或更高再加入，接着将样品管加热到94℃直接进入PCR循环。2/5/2023

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33分子生物学技术重要参考书2/5/2023

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34DNA的提取和检测为进行DNA的扩增，首先要进行DNA的提取和检测。DNA提取的不同方法：

CTAB

、SDS、尿素法、SDS～CTAB、浓盐法等紫外吸收法测定核酸种类、含量2/5/2023

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35DNA提取的方法2/5/2023

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36细胞破碎抽提去蛋白质沉淀核酸植物DNA提取的基本过程2/5/2023

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37植物DNA提取的不同方法CTAB（溴代十六烷基三甲胺）法

CTAB是一种去污剂，可溶解细胞膜并能与核酸形成复合物，便于DNA的抽提；还可保护DNA免受内源核酸酶的降解，使蛋白质变性而沉淀。1×CTAB（溴代十六烷基三甲胺）DNA提取液

1%（W:V）CTAB50mmol/LTris-HCl（pH8.0）

10mmol/LNa2EDTA0.7mol/LNaClSDS（十二烷基硫酸钠）法可溶解膜蛋白而破坏细胞膜，使蛋白质变性而沉淀。

浓盐法（RNA能溶于0.14mol/L的NaCl溶液中，而DNA难溶其中，据此特性可将两者分开。DNA易溶于0.5～1mol/L的NaCl溶液中，因此可利用1mol/L的NaCl溶液提取DNA。）尿素法：尿素是一种变性剂，如6～8mol/L尿素为中强变性剂。蛋白质在受热或在高浓度的尿素、盐酸胍（8M脲和5M盐酸胍）等化学试剂存在下会丧失活性，该现象称为蛋白质的变性。2/5/2023

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38植物DNA提取方法的要点细胞破碎→细胞（匀）浆可用机械破碎法：如研磨。核酸分离、纯化应在0～4℃，以防核酸变性或降解。Tris缓冲液

Tris的化学性质稳定，作用是保持溶液的电中性及pH。在提取液中加入适量EDTA或柠檬酸盐可抑制Dnase活性，又可使蛋白质变性而与核酸分离。β-巯基乙醇具还原剂性质，能防止过氧化物对分离物的破坏、分解。从核酸样品中除去蛋白质时常常使用苯酚/氯仿/异戊醇（25:24:1)。苯酚/氯仿可与水作用能破坏蛋白质分子周围的水膜，同时改变溶液的介电常数，导致蛋白质变性溶解度降低而沉淀析出。经过离心，变性蛋白质的密度比水的密度大，因而与水相分离，沉淀在水相下面，从而与溶解在水相中的DNA分开。加入异戊醇能降低分子表面张力，能减少抽提过程中的泡沫产生。异丙醇、乙醇可选择性的沉淀DNA，而RNA仍留在溶液中。2/5/2023

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39抽提DNA去除蛋白质时，怎样使用酚与氯仿较好？酚的变性作用大，但酚与水相有一定程度的互溶，大约10％～15％的水溶解在酚相中，因而损失了这部分水相中的DNA。氯仿的变性作用不如酚效果好，但氯仿与水不相混溶，不会带走DNA。所以在抽提过程中，混合使用酚与氯仿效果最好。为什么用酚与氯仿抽提DNA时，还要加少量的异戊酵？在抽提DNA时，为了混合均匀，必须剧烈振荡容器数次，这时在混合液内易产生气泡，气泡会阻止相互间的充分作用。加入异戊醇能降低分子表面张力，所以能减少泡沫产生，同时异戊醇有助于分相，使离心后的上层水相，中层变性蛋白相以及下层有机溶剂相维持稳定。一般采用酚、氯仿与异戊醇之比为25：24:1（不必先配制，可在临用前把一份酚加一份24：1的氯仿与异戊醇即成）。2/5/2023

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40实验材料研磨加入提取液

获得植物汁液研钵及其它容器应事先高压灭菌，再烘干。植物汁液加入离心管2/5/2023

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41DNA提取的重要仪器

高速离心机离心管加入离心机前必须对离心管进行配平衡2/5/2023

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42打开离心机的盖子离心管放入离心机转子离心管的正确放置插好离心管2/5/2023

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43紫外吸收法测定核酸种类及含量原理：DNA和RNA的吸收峰在260nm处。蛋白质由于含有芳香族氨基酸，吸收峰在280nm处，在260nm处的吸收值仅为核酸的十分之一或更低，故核酸样品中蛋白质含量较低时对核酸的紫外测定影响不大。RNA的260nm和280nm吸收的比值在2.0以上，DNA的260nm和280nm吸收的比值在1.9左右，当样品中蛋白质含量较高时比值即下降(比值≥1.8，表示蛋白质含量不超过0.3％)。在实际测定中，将样品稀释成每mL含5～50μg核酸的浓度，可利用在260nm下的吸收值来求出核酸的浓度。DNA浓度（μg/mL）＝A260/0.020/L*稀释倍数式中：A260为260nm下的吸收值；L为比色池厚度，一般为1或0.5；0.020为每mL溶液内含1μgDNA钠盐的吸光度.紫外可见光分光光度计2/5/2023

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44琼脂糖凝胶电泳检测DNA扩增产物由于DNA核酸分子比蛋白质分子大得多，通常采用有较大孔径的琼脂糖凝胶来分离核酸。由于核酸分子本身中含有大量的磷酸根，所以带有负电荷，在电场中会向正极移动。试剂和仪器水平电泳槽、电泳仪2/5/2023

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45PCR仪——基因体外扩增仪PCR仪配套用品2/5/2023

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46PCR扩增产物的琼脂糖电泳分析

AnaysingtheresultsofaPCRbyagarosegelelectrophoresis待分析的DNA样本2/5/2023

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47水平电泳槽、电泳仪2/5/2023

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48

制备凝胶板

2/5/2023

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49加样2/5/2023

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50水平电泳图示凝胶板上的电泳条带凝胶板上的电泳前端用溴酚蓝指示加样孔2/5/2023

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51电泳分离不同大小的DNA片断2/5/2023

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52凝胶成像仪凝胶板上的电泳条带2/5/2023

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53（三）PCR技术的发展以PCR技术为基础与其它最新技术相结合,进一步发展了反转录PCR

、免疫捕捉PCR、实时荧光定量PCR、多重聚合酶链反应等复合PCR技术。这些方法提供了更快捷、特异、准确、高效检测植物病原物的方法.2/5/2023

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541.反转录PCR（RT-PCR）1.反转录PCR（RT-PCR）目前PCR技术只能扩增DNA模板，而TaqDNA聚合酶不能以RNA为模板进行扩增。利用逆转录酶能将RNA逆转录成DNA的特性，通过合适的引物，将RNA（一般为mRNA)逆转录成cDNA，然后，通过PCR技术，将痕量的cDNA扩增成大量的双链DNA。这种在RNA反转录后进行的PCR扩增称为RT-PCR

（ReversetranscriptionPCR,简称RT-PCR）。大多数植物病毒基因组为RNA，为检测植物病毒，就需要应用反转录PCR技术，首先在逆转录酶的作用下，以RNA为模板合成互补的第一链cDNA，之后进行常规PCR反应。cDNA：互补DNA，具有DNA的功能，且其中没有内含子。2/5/2023

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55逆转录示意图cDNA链合成,互补mRNA链，一般利用polyT作引物，也可用特异性的序列作为引物GUAAUCCUCAAAAAAAAAAAAAAAReversetranscriptasemRNAcDNATTAGGAGTTTTTTTTTTTTTTT逆转录polyT引物2/5/2023

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56反转录PCR原理示意图逆转录酶ＤＮＡ聚合酶RNAcDNA杂化双链PCR扩增将mRNA逆转录成cDNA这个步骤与转录是相反的，因此叫逆转录酶。

逆转录酶（reversetranscriptase）是存在于RNA病毒体内的依赖RNA的DNA聚合酶。至少具有以下三种活性：

1、依赖RNA的DNA聚合酶活性：以RNA为模板合成cDNA第一条链；

2、Rnase水解活性：水解RNA/DNA杂合体中的RNA；

3、依赖DNA的DNA聚合酶活性：以第一条DNA链为模板合成互补的双链cDNA。Taq

酶

2/5/2023

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57反转录PCRcDNA2/5/2023

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58RT～PCR检测番木瓜环斑病毒电泳结果2/5/2023

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592.免疫捕捉PCR（IC-RTPCR）特异性抗体抗原2.免疫捕捉PCR（IC-RTPCR）是根据ELISA的原理，直接从植物粗提液中进行免疫捕捉病毒，目的在于浓缩和纯化病毒粒子，之后再利用RT-PCR

检测目的片断。基本流程（反应在0.5mL离心管中进行）：包被抗体→捕捉抗原→病毒核酸释放（98℃，3min）→反转录反应→PCR扩增→产物检测。反转录PCR反应体系离心管反转录反应→PCR扩增2/5/2023

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60免疫捕捉PCR有以下优点免疫捕捉PCR具有以下优点:(1)在PCR扩增前，有免疫捕捉的过程以及引物的高度特异性,提高了检测的灵敏度（上百倍）。ELISA一般能够检测到的病毒浓度是1ng/mL,但是IC-RTPCR一般只需要1～10pg/mL.(2)能直接从植物粗提液中检测病原物，而省去PCR模板的纯化,这对于核酸提取困难的样品特别适用。利用抗原与抗体的结合，能除去植物粗提液中的PCR抑制物。2/5/2023

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613.实时荧光定量PCR3.实时荧光定量PCR(RealtimefluorescentQuantitativePCR，RT-FQPCR)是美国PE（PerkinElmer）公司1995年研制出来的一种新的核酸定量技术，简称FQ-PCR。该技术是在PCR反应体系中加入非特异性的荧光染料（如：SYBRGREEN）或特异性的荧光探针（如：Taqman探针），实时检测荧光量的变化。获得不同样品达到一定的荧光信号（阈值）时所需的循环次数CT值（CycleThreshold）；通过将已知浓度标准品的CT值与其浓度的对数绘制标准曲线，就可以准确定量样品的浓度。FQ-PCR是PCR反应一面进行，机器一面利用萤光侦测技术与计算机分析技术记录PCR的反应结果，当反应完成时，检验结果就立即呈现。2/5/2023

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SYBRGreen能结合到双链DNA的小沟部位

SYBRGreen只有和双链DNA结合后才发荧光。变性时，DNA双链分开，无荧光。复性和延伸时，形成双链DNA，SYBRGreen发荧光，在此阶段采集荧光信号。SYBRGreen法优点：使用方便不必设计复杂探针，非常灵敏，便宜。SYBRGreen法缺点：容易与非特异性双链DNA结合，产生假阳性。SYBRGreen实时荧光定量PCR方法1

SYBRGreen法2/5/2023

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63实时荧光定量PCR方法2TaqMan法探针与目标序列配对时

，发生FRET光能量转移Taq游离的探针荧光基团

淬灭剂

延伸时，Taq酶水解探针，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离而发出荧光，形成荧光信号

Taq发出荧光光另一波长的光在常规PCR基础上，反应体系添加“荧光双标记探针”，探针的5′端为荧光报告基团，3′端为荧光淬灭基团，两者构成能量传递结构，5′端荧光报告基团的荧光可被荧光淬灭基团吸收掉，转化为其他波长的发射光或热能，称之为FRET。在目标DNA扩增过程中，探针水解，荧光素和淬灭剂分开，淬灭剂对荧光素的抑制作用消失，从而引起报告基团荧光信号的增长。由于探针必须遇到模板才能实现水解，故非特异性扩增不会被检测。2/5/2023

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64实时荧光定量PCR方法3分子信标法探针杂交到DNA模板光发出荧光荧光基团DNA模板淬灭剂

茎

环光淬灭在目标DNA扩增过程中，分子信标型探针构型变化，荧光素和淬灭剂分开，淬灭剂对荧光素的抑制作用消失，从而引起报告基团荧光信号的增长。标记荧光的发夹探针：环与目标序列互补茎由互补配对序列组成2/5/2023

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65实时荧光定量PCR

对起始DNA的定量方法实时荧光定量PCR对起始DNA的定量方法为：原理：初始DNA量越多,荧光达到某一值（Ct阈值）时所需要的循环数越少。Ct值和初始DNA量的对数值呈线性关系。制定标准品的Ct值和初始DNA量的对数值之间的标准曲线。根据样品的Ct值就可准确定出起始DNA数量。Ct值（Cyclethreshold）

：指在PCR循环过程中荧光信号到达设定的域值的循环次数。经数学证明，Ct值与模板DNA的起始拷贝数的关系：N＝N0(1+E)n

logN=nlog(1+E)+logN0

n=(logN0-logN)/log

(1+E)Ct

=A

+B·logN02/5/2023

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664.多重聚合酶链反应4.多重聚合酶链反应（MultiplexPCR）不同的植物病毒或其它病原物可能会同时侵染同一种植物，如要逐个检测，操作较为繁琐。多重聚合酶链反应技术可在一次PCR反应中，同时加入几对特异性引物(要注意各引物比例适当)，从而同时扩增、检测出不同的病原物(DNA或者RNA).这就为检测工作提供了极大的便利。2/5/2023

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67（四）PCR技术在植物病理学中的应用1.检测病原物的种类2.检测病原物的数量3.分析转基因植物外源基因拷贝数2/5/2023

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68检测病原物种类的办法找到某种病原物的特异性核酸序列，对待检病原的核酸进行该序列的PCR扩增。扩增结果阳性，表示待检病原为特定病原物；扩增结果阴性，表示待检病原非特定病原物。2/5/2023

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691.检测病原物的种类王杰等（2005）建立了能直接以大豆干种子为检测对象的SMV快速、灵敏、特异的RT-PCR检测技术，从而为防治大豆花叶病提供了关键技术。Jansen等在检测ToMV(Tomatomosaicvirus)和TMV(Tobaccomosaicvirus)的过程中，发现这两种病毒的抗血清交互反应，ELISA不能区分出这两种不同的血清型。但应用IC-RT-PCR

时，只要病毒浓度在10～100fg/mL之间，TMV或者ToMV

就能被检测到，能扩增出各自的分离物。2/5/2023

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70检测病原物的种类Korimbocus

等报道，利用实时荧光PCR

检测到侵染甘蔗的ScYLV(SugarcaneYellowleafvirus),其灵敏度是常规PCR的100倍，

能从反转录PCR，ELISA等方法检测不到ScYLV的样本中检测到该病毒。Murray等报道，多重免疫捕捉反转录PCR能够同时检测和区分出侵染香蕉的BBTV、BBrMV

、CMV等3种病毒。Bertolini

等报道了用多重反转录PCR

能同时检测到侵染橄榄树的CMV等6种RNA病毒。2/5/2023

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712.检测病原物的数量目前，实时荧光PCR方法被评价为检测土壤等样品中微生物种类和数量的最有效方法。2/5/2023

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723.分析转基因植物外源基因拷贝数杨立桃等（2005）利用实时荧光定量PCR

方法分析转基因水稻外源基因拷贝数，3个植株定量PCR分析的转基因拷贝数稍高于SouthernBlot

的分析结果。主要原因是SouthernBlot方法在同一个插入位点有多拷贝的T-DNA片段插入时,转基因植株的基因组在完全酶切时会产生相似的DNA片段,电泳分析时很难分辨清楚。定量PCR方法则完全避免了这种情况的发生,除非目的基因DNA片段在PCR引物处发生断裂。两种方法分析结果的比较显示定量PCR方法分析转基因拷贝数更加有效、适用。2/5/2023

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73二.RAPD方法与

SCAR标记（一）RAPD方法的基本原理（二）SCAR标记（三）RAPD技术及SCAR标记在植物病理学中的应用2/5/2023

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74二.RAPD方法与SCAR标记RAPD，即随机扩增多态性DNA

(RandomAmplifiedPolymorphicDNA，RAPD)是由美国杜邦公司的Williams(1990)和加利福尼亚生物研究所Welsh两个小组在PCR技术基础上，发展起来的简便快速的检测DNA多态性的方法。此技术对基因组的DNA全部进行PCR扩增，以检测多态性。由于整个基因组存在众多反向重复序列，单一随机引物与反向重复序列结合,使重复序列之间的区域得以扩增。由于该方法可在缺乏任何分子生物学研究背景的物种上应用（构建基因组指纹图谱、阐明物种亲缘关系等），且研究费用低廉，表现出独特的优势，获得了广泛应用。由于PCR方法只能对已经了解了基因序列的情况下才能使用，就极大的限制了其应用范围。为在缺乏任何分子生物学研究背景的物种上应用（检测、鉴定病原物、阐明物种亲缘关系等），就产生了RAPD方法。2/5/2023

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75RAPD方法的缺点在RAPD方法获得广泛应用的同时，也发现了该方法的最重要的缺点—标记检测结果的不稳定性。N.F.Weeden等人的研究表明，RAPD标记检测误差在5%～10%之间。Paran和Michelmore(1993)提出的SCAR标记技术可以解决这一问题。2/5/2023

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76（一）RAPD方法的基本原理RAPD标记技术就是用一个（有时用两个）随机引物（一般8～10个碱基）非定点地扩增基因组DNA，然后用凝胶电泳分开扩增片段。模板DNA经92～94℃变性解链,在足够低的温度下(35～37℃,一般低于40℃)与单个随机引物(一般为10个碱基)退火,如果互补的两条DNA链上的2个退火位点足够接近(约200～2000bp),通过延伸便可扩增出DNA片段。整个基因组存在众多反向重复序列，单一引物与反向重复序列结合,就会使重复序列之间的区域得以扩增。如此30次PCR循环也将产生上百万倍的扩增产物。200～2000bp反向重复序列反向重复序列2/5/2023

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77RAPD方法的基本原理对于特定引物，不同生物类群的基因组DNA退火位点总有不同,能否扩增以及扩增产物的种类、长度就有所不同。可用电泳检测使用特定引物时DNA能否扩增及扩增片断的（种类）长度的多态性图谱。不同物种，产生的多态性不同。故，可用此方法检测、鉴定病原物（扩增产物完全一样，则两者为相同生物）

；研究不同病原物的亲缘关系（扩增产物越相似，亲缘关系越近）。2/5/2023

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780.2kb0.5kb0.3kb0.2kb0.5kb0.3kb×0.2kb0.3kb0.5kb品系1品系22/5/2023

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79通常采用30个以上的随机引物扩增来筛选出若干可有效扩增的引物通常采用30个以上的随机引物，进行30次以上的扩增,就可获得一组目标基因组DNA多态性的实验数据。同一生物类群具有相似的遗传背景，扩增获得的DNA多态性的实验数据也是相似的；对不同生物类群来说，获得的DNA多态性的实验数据也不相同。通过对目标基因组DNA进行RAPD扩增获得的DNA多态性实验数据用统计方法处理后（如进行聚类分析，以树状聚类图方式表达等），则可以得到相应的DNA遗传、分类、进化等更多信息。2/5/2023

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80RAPD分析技术实验流程RAPD分析技术实验流程包括:(1)模板DNA的提取纯化；(2)用随机引物进行DNA扩增（不少于30个随机引物）；(3)扩增产物的检测；(4)用统计方法处理。2/5/2023

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81烟草野火病抗性基因的RAPD分析徐秀红采用了423条随机引物对抗病亲本Ky14和感病亲本SpeightG-140进行RAPD分析，其中9条引物能在抗、感亲本间稳定扩增出有差异的条带。9条引物在抗、感亲本间的扩增差异见图。

2/5/2023

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82烟草野火病抗性基因的RAPD分析将以上9条引物在抗、感基因池间进行扩增检测，结果只有引物S52在抗、感基因池间显示出多态性差异，6次重复扩增，结果稳定。S52产生的差异片断约2000bp，记作标记S522000。S52在抗、感基因池间的扩增结果见图。

初步推断，该标记与来自N.longiflora的烟草野火病抗性基因存在连锁。一族群中所有基因的集合为基因池（genepool）抗病基因池：多个抗病品种DNA的混合物。感病基因池：多个感病品种DNA的混合物。2/5/2023

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831.30001.19750.89500.77760.70660.61790.82990.67950.573100.50.60.70.80.91.01.11.21.3QYE3GXE1BEEBE4ABHU根据RAPD分析绘制出的10个生物群体的聚类图2/5/2023

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84（二）SCAR标记为解决RAPD标记的不稳定性问题，

Paran和Michelmore(1993)

提出了序列特异性扩增区技术（sequencecharacterizedamplifiedregion，SCAR）。与RAPD

标记法相比，SCAR标记PCR反应条件严谨、结果稳定、重复性强，在应用上具有快速、简便、低成本的特点，已成为多种分子标记中的首选标记。2/5/2023

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85SCAR标记原理该技术是通过对RAPD扩增产物测序的基础上，设计一对新的引物特异地扩增原引物可扩增的DNA片段。一对新的引物：分别在原RAPD引物的3’与5’端各延长10～14个碱基。延长后的每个引物为18～24个碱基。除将引物加以改变以外，还应将PCR扩增条件加以适当调整：退火温度为60～66℃、MgCl2

浓度常为1.5mmol/L。…2/5/2023

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86（三）RAPD技术及

SCAR标记在植物病理学中的应用1.鉴定病原物的种类2.研究某些病原菌类群间的亲缘关系3.进行抗病基因的标记定位2/5/2023

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871.鉴定病原物的种类区别形态相似的病原物：

特定引物扩增可在某病原物中获得特定的DNA谱带，而在另一病原物中无此带出现，此特异片段就是一种鉴定标记。于拴仓等（2005）利用RAPD技术筛选了4个引物，可以将番茄叶霉病菌生理3

个生理小种完全区分开来。康振生等（2005）用210条随机引物对中国小麦条锈菌(Pucciniastriiformisf.sp.tritici)5个主要生理小种进行了RAPD分析,获得了条中29号小种专化的SCAR标记。曹丽华等建立了小麦条锈菌条中31号小种SCAR检测标记。2/5/2023

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882.研究某些病原菌类群间的亲缘关系利用30个以上随机引物的（特定）扩增条带的有无（1，0），进行聚类分析，研究不同病原物的亲缘关系（扩增产物越相似，亲缘关系越近）。吴小芹等（2005）对来自日本、韩国、美国、加拿大和中国大陆6省及台湾地区的松材线虫和拟松材线虫16个虫株的基因组DNA进行RAPD分析，结果显示,松材线虫和拟松材线虫明显分为两大类。

在松材线虫群体中,又可分为3个亚组:

中国大陆虫株与日本虫株为一亚组,加拿大虫株为一亚组,中国台湾虫株与美国虫株为一亚组。

拟松材线虫群体亦可分为两亚组:

一为日本、中国台湾和中国江苏虫株,

二为韩国和中国湖南虫株。2/5/2023

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893.进行抗病基因的标记定位如利用多个抗病、感病品种进行RAPD扩增，也可望找到抗病、感病品种有差异的扩增带，则抗病品种共有的带上即存在抗病基因。张志永等(1998)对30个栽培大豆品种进行了RAPD指纹图谱分析。结果表明：较短的片段S—5600和S—05660是抗病品种的特征性条带;而较长片段S—51000和S—51600是感病品种的特征性条带。2/5/2023

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90三.RFLP和AFLP技术（一）RFLP的基本原理（二）AFLP的基本原理2/5/2023

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91三.RFLP和AFLP技术限制性片段长度多态性（RestrictionFragmentLengthPolymorphism，RFLP）是Bostein和White等人于1980年首次提出的分子标记技术。RFLP技术的优越性在于稳定性好、可靠。但此法费用高，周期长，多态性水平低，限制了这种技术的应用。扩增片段长度多态性（AmplifiedFragmentLengthPolymorphism，AFLP）是由荷兰科学家M.Zabeau和P.Vos于1993年提出的分子标记技术。AFLP结合了RFLP的稳定性和PCR技术的高效性，它无需基因组DNA的背景资料即可完成模板DNA多态性的检测，可产生丰富而稳定的遗传标记,被认为是一种高效的分子标记技术。2/5/2023

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92（一）RFLP的基本原理生物不同类群的DNA序列中，总会存在许多不同的限制性内切酶识别位点。因而，当某一特定的限制性酶切割DNA时，就会产生酶切DNA片段长度的差异。这种差异可反映在电泳图谱上。检测出的特异带型是鉴别物种、分析类群间类缘关系等的科学依据。对于每一个DNA基因组/限制性内切酶组合来说，所产生的片段长度多态性是特异性的，故RFLP被称为DNA指纹。2/5/2023

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93DNA提取→用DNA限制性内切酶消化

→凝胶电泳分离限制性片段

→将这些片段按原来的顺序和位置转移到易操作的滤膜上

→用放射性同位素或非放射性物质标记的DNA作探针与膜上的DNA杂交（称Southern杂交）

→放射性自显影或酶学检测显示出不同材料对该探针的限制性酶切片段多态性。

RFLP的基本步骤用限制性酶来酶解高等生物核DNA会产生数万个片段，其大小变化是连续的，如进行电泳分离，只能看到弥散状的连成一片的电泳结果。然而，各限制片段在凝胶中还是分开的，但不能分辨。进行Southern印迹转移操作，用特定的探针与滤膜上的DNA杂交，经过放射自显影就能检测到高等生物核DNA的RFLP。2/5/2023

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94酶切，电泳后（转膜杂交自显影）检测结果较大片段RFLP标记技术的基本手段就是通过电泳的方法分离这些片段。转膜、杂交、自显影后检测结果较小片段2/5/2023

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95（二）

AF