第二三章 紫外可见吸收光谱法

第二章紫外-可见吸收光谱法2.1信号和信息的特征2.2紫外-可见吸收光谱法定量分析基础2.3紫外可见分光光度计的基本组成与结构2.4紫外可见分光光度法的基本实验技术2.5紫外可见光谱法的应用光谱分析概述光学分析方法：待测物受到某种能量作用后，产生光等信号或引起光信号变化的分析方法光谱类型：分子光谱、原子光谱光与物质相互作用的方式反射，漫反射反射光谱法吸收与透射吸收光谱法发射发射（荧光）光谱法散射散射光谱法折射衍射与干涉偏振与旋光光的波粒二象性

1.光的波动性电场磁场xyz传播方向Diagramwastakenfrom:DouglasA.SkoogandJamesJ.Leary,PrinciplesofInstrumentalAnalysis,4thed.,SaundersCollegePublishing,1992,page61.光波的描述ln波长(m、mm，nm)频率(Hz)；c光速(=3.0*1010cm/sec)

0246810-1.0-0.50.00.51.0lOnecyclenl=c

光的粒子性E=hv;E(eV)=1240/l(nm)=h（普朗克常数）=6.63x10J/s频率-34n=-

波数wavenumber(cm-1)nln1/Planck方程：统一:

P=h/l电磁波谱g-射线X-射线可见红外微波射频2004008003200(nm)波长真空紫外可见与红外核磁共振波长减小，能量增加紫外

光谱的基本类型物质的颜色:物质对不同波长的光具有选择性的吸收作用而产生的。物质呈现的颜色和吸收的光颜色之间是互补关系。分子的内部运动原子内部粒子的运动：Eatom

=Enuclear+E电子绕核+E电子自旋

对氢原子来说，电子绕核运动的能量为：En=-13.6/n²(eV)UV-VISE电子自旋ESRE核自旋NMR分子内部的粒子运动Em=E0+Ek+Ee+Ev+ErEm分子能E0零点能Ek

平动能Ee

价键电子能（1~20eV)：UV-VISEv

原子振动能(0.05~1eV):IREr

分子转动能(<0.05eV):FIR电子跃迁基态E0激发态E1DE=E1-E0=hn能级辐射e能级差DE光与物质的相互作用E=Em-En=hv跃迁定则*光的颜色与物质的颜色（温度颜色）；*辐射、吸收与跃迁（光强几率，波长能级）；

5BasicHues:red(R),yellow(Y),green(G),blue(B)andpurple(P).粒子结构与光谱特征粒子特征粒子能级光谱特征运动状态变化辐射层次光谱研究2.1信号和信息的特征2.1.3分子外层价键电子的轨道与能级2.1.2紫外可见光谱的信息2.1.3信息负载的宏观过程

特点紫外-可见(ultraviolet-visible简称UV-VIS)吸收光谱分析:利用分子内电子,跃迁产生紫外-可见吸收光谱来进行定性定量分析。原子的d,f轨道电子2.1.3分子外层价键电子的

轨道与能级原子轨道:S,P,D,F分子轨道:s,p,n,p*,s*分子轨道具有不同的能级，这些能级的允许跃迁产生分子吸收光谱。

STRUCTUREANDENERGYNon-bondingOrbitalsOrbitalp*OrbitalpOrbitals*OrbitalUnoccupiedlevelOccupiedlevelEnergylevel2.1信号和信息的特征2.1.1分子外层价键电子的轨道与能级2.1.2紫外可见光谱的信息2.1.3信息负载的宏观过程

1.产生UV-VIS吸收的几种跃迁s

s*:CC,CH;pp*:C=C,C=O,CC;（K带）n

s*:O,N,P,卤素;np*:同时有n,p轨道;（R带）共轭PP*:具有共轭P键；电荷迁移:d,f电子跃迁：过渡金属元素分子轨道能级与跃迁nm10020030040050060070080001234lgess*ns*np*pp*共轭PP*>C=O,>C=S,>C=N,N=N,-N=O,-NO2C-S,O-C,N-C2.简单分子的紫外-可见吸收法

分子跃迁lmax(nm)R-OHR-O-RR-NH2R-SHR2C=CR2R-C=C-RR-C-NR-N=N-Rs*ns*ns*ns*np*pp*ps*ns*n180180190210175170160340分子Transitionlmax(nm)R-NO2R-CHOR2CORCOOHRCOORRCONH2p*np*pp*np*pp*np*np*np*n271190290180280205205210简单分子的紫外-可见吸收.E带E带R带含氮化合物3.共轭分子一般地说，每增加一个共轭双键，则吸收波长增加约30nm。EFFECTOFCONJUGATIONDiagramwastakenfrom:DonaldL.Paviaet.al.,IntroductiontoSpectroscopy,SaundersGoldenSunburstSeries,1979,page192An=3Bn=4Cn=5200300380Wavelength,nmLogeUVSpectrumofDimethylpolyenesCH3(CH=CH)nCH3(1)共轭二烯链式217nm同环214nm异环253nm(2)a,b-不饱和酮链式215nm五元环202nm六元环215nm4.苯及衍生物E带:180~184nm(e=47000)K带:200~204nm(e=7000)B带:230~270nm(e=200)SPECTRUMOFANTHRACENEWavelength(nm)AbsorbanceC14H105.大分子

b-胡萝卜素的吸收光谱β－胡萝卜素DOESITABSORBINTHEUV/VISREGION?CH3CH3CH3OHVitaminA1叶绿素的吸收光谱叶绿素的分子能级按光谱分析理论可以理解：该系统可以最充分与有效地利用太阳能。结论

植物色素系统是若干亿年生物进化的结果，按光谱分析理论可以理解：该系统可以最充分与有效地利用太阳能。分子结构吸收光谱生物功能2.2.1比尔定律吸光度A=lgI/I0=lg=e

Cl1T其中T:透过率Transmittancee:摩尔吸收系数Molarextinctioncoefficientl:光程PathlengthC:浓度Concentratione单位：1/(mol*cm)2.2紫外-可见吸收光谱法定量分析基础2.2.2比尔定律与光谱的表达2.2.3比尔定律图解2.2.4比尔定律的局限性物质只能吸收特定频率的光（单色光）；无限稀溶液（各物质的吸收独立）；物质间无相互作用（物质之间，物质与样品间）。实际因素非单色光（<1/5光谱带宽）非平行光光的散射（或漏光、高级衍射光）高浓度（>0.01M）化学作用（pH,电离，缔合等）荧光折光系数的改变仪器噪声EFFECTOFSTRAYLIGHT1.02.002.55.07.510.0Concentration,M*103Absorbance0.0%0.2%1.0%5.0%Straylight=*100IsIoDiagramwastakenfrom:DouglasA.SkoogandJamesJ.Leary,PrinciplesofInstrumentalAnalysis,4thed.,SaundersCollegePublishing,1992,page131.EFFECTOFpHVALUEDiagramtakenfrom:JamesD.IngleJr.andStanleyR.Crouch,SpectrochemicalAnalysis,prentice-HallInternationalEditions,page3741.00.90.80.70.60.50.40.30.20.10325400475550625700(nm)Absorbance10986.869876.86.56AbsorptionSpectrumofPhenolredatVariouspHvalues第三章紫外-可见吸收光谱法3.1信号和信息的特征3.2紫外可见分光光度计的基本组成与结构3.3紫外可见分光光度法的基本实验技术3.4紫外可见光谱法的应用3.2紫外-可见分光光度计的基本组成与结构3.2.1基本组成

光源单色器样品室检测器显示器钨灯氘灯滤光片棱镜光栅光电池光电管光电倍增管V0I0VI当切断光线时，调0HW红蓝S2紫外-可见与红外分光光度计的设计单色器的结构Δλ单色器的性能棱镜分辨率：R=b(dn/dλ)光栅分辨率：R=mN单色器带宽：Δλ=S(dl/dλ)-1=S(dδ/dλ)-1/f2.3.2整机的光路结构1.单光束紫外-可见分光光度计的光路结构2.双光束分光光度计3.双光束双波长分光光度计λ1λ2光源单色器I1I2R=V1/V2=I1/I2斩光器PMT参比波长测得信号为：R=V1/V2=I1/I2光源单色器遮光板参比池样品池斩光器PMT双光束双波长分光光度计光路图4.其它类型(二极管阵列)PumpingSystem

-ImprovedSealLongevity-2.4基本实验技术2.4.1分光光度计的选用与性能调试2.4.2分光光度计的校正2.4.3分析条件的设定2.4.4定量分析的方法2.4.5定量分析结果的评价2.4.6提高定量分析准确度的方法分析的准确度性能主要因素调试方法影响光学波长范围光学器件检查特征波长的能量适应性波长精确度光学系统的结构波长由大至小和由小至大分别检查同一波长的重复性分析的精确度波长准确度光学系统的结构用已知波长的单色光来校正（如氘灯656.1nm，486.0nm,汞灯，苯峰247.1,252.9,258.9nm等）性能主要因素调试方法影响系统作用光能量见公式3.11测定仪器能量输出检出限单色光带宽狭缝和线色散用原子，分子光谱谱线（如氘灯，汞灯）来检查准确度杂散光强度光学系统结构，器件表面缺陷和散射标准物NaBr测定检出限性能主要因素调试方法影响光度计整机光度计准确度器件非线形光学器件检查标准物的吸收准确度信噪比器件与环境噪声波长、狭缝、增益等参数不变测定信号变化的幅度精确度准确度分析速度器件响应速度、系统结构见手册精确度准确度2.4.2分光光度计的校正2.4.2分光光度计的校正表观光谱与真实光谱单光束：相对强度双光束：绝对强度2.4.3分析条件的设定1.分析波长的选择原则:一般选择最大吸收波长。特殊情况:a.有干扰时(干扰成份或干扰峰)；b.溶剂影响;c.带宽不满足要求时.2.仪器带宽的选择带宽对分析的影响整机带宽<(1/5~1/10)光谱带宽3.吸光度范围的选择吸光度范围：0.2~0.8abs特殊情况：吸光度太小：加大光程吸光度太大：减少光程，稀释原液4.参比的选择理论上，参比应该是样品中除分析成分外的所有物质；实际中，用什么做溶剂就用它作参比。*比如，水溶液或乙醇溶液、丙酮溶液。*溶剂的选择：截至波长,极性小*溶剂极性对最大吸收波长的影响。SOLVENTCUT-OFFSAcetonitrileChloroformCyclohexane1,4-Dioxane95%Ethanol190nm240195215205n-HexaneMethanolIsooctaneWaterTrimethylphosphate201nm205195190210溶剂极性的影响非极性溶剂极性溶剂nnp*ppp*n-p*p-p*p-p*n-p*能量溶剂极性溶剂极性增加，p-p*跃迁红移n-p*跃迁蓝移2.4.4定量分析的方法公式法:比尔定律，e值已知，l准确。工作曲线法：克服随机误差，l准确度的影响减小。标准加入法2.4.5定量分析结果的评价灵敏度，检测限，精确度，准确度，线形范围，回收率灵敏度与e值的关系:1.e>10E(4),高灵敏度；2.e=10E(3~4)，中等灵敏度；3.e<10E(3),低灵敏度。

2.4.6提高定量分析准确度的方法(折射示差法）1.高吸收法:当吸光度>0.8abs时;050%100%050%100%C1T1TrTP真实表观C2.低吸收法:当吸光度<0.2abs时050%100%050%100%CTrTP真实表观T2C23.最精确法:当吸光度相近时。050%100%050%100%C1T1TrTP真实表观T2CC2局限性表面上看，折射示差法的应用是不受限制的，实际并不如此，随着放大倍数a的增加，必须加大狭缝和提高检测器的灵敏度，导致噪声升高，且偏离线形。2.双波长法和多组分测定ab比尔定律满足线性加和性；用于悬浊液。3.导数光谱法作用：扣除慢变化背景和散射背景，提高分辨率导数光谱消除宽背景吸收干扰分辨两个紫外光谱相近组份2.5紫外可见光谱法的应用2.5.1定性分析：确定官能团异构，双键共轭情况等。(1)如200~400nm无吸收,则无共轭。(2)如230~270nm有吸收，e=100~1000，则有芳香化合物。(3)如270~350nm有吸收，e=10~100，且200~270nm无峰，则为n--p*;若200~270nm有峰，则可能是a、b--不饱和酮。(4)如200~400nm，则可能是长共轭体系或稠环、杂环化合物。

2.5.2定量分析定量分析的基础是比尔定律。叶绿素含量测定；氨基酸含量测定：水合茚三酮580nm(蓝紫）蛋白质含量测定：利用苯丙氨酸，色氨酸，酪氨酸的芳香环吸收直接测定。染色法：coomassieblueDOESITABSORBINTHEUV/VISREGION?HNCH2CHNH2COOHTryptophanMOLECULARSTRUCTUREOF

COOMASSIEBRILLIANTBLUESPECTRUMOFCOOMASSIE

BRILLIANTBLUE2.5.3其它应用1.DNA纯度分析：A280：A260：A230=0.515:1:0.45核酸及蛋白质的重要波长：230nm:核酸光谱最小吸收，蛋白质肽键;260nm:核酸280nm:蛋白质的芳香氨基酸及肽；320nm:蛋白、核酸均无吸收。ACTG脱氧核苷三磷酸盐（dNTP）GACT纯蛋白质（杂质）282nm混合物259nm双链DNAPCR引物及其对应单链的熔点测定熔化过程曲线及导数光谱熔化过程曲线