十六章-抗生素药物的分析

第十六章抗生素类药物分析第一节概述一、抗生素的定义及特点◆低化学纯度－同系物多、异构体多、降解物多◆活性组分的变异性－生产过程中条件的变化◆不稳定性－不稳定性结构

是指“生物在其生命活动中产生的，能在低微浓度下有选择地抑制或影响它种生物机能的化学物质的总称”抗生素的分类β－内酰胺类抗生素四环素类抗生素氨基糖苷类抗生素大环内酯类抗生素多烯大环类抗生素－制菌霉素、两性霉素多肽类抗生素－放线菌素、多黏菌素酰胺醇类抗生素－氯霉素抗肿瘤类抗生素其他抗生素二、抗生素类药物的分类按化学结构分三、抗生素类药物的细菌耐药性三、抗生素类药物的细菌耐药性◆1、耐药性的种类固有耐药性：天然耐药性，由细菌染色体基因决定获得性耐药性：◆2、耐药的机制（1）产生灭活酶，使抗菌药失活如β-内酰胺酶（2）抗菌药物作用靶位改变（3）降低细菌外膜通透性（4）影响主动流出系统四、抗生素药物的质量分析鉴别试验㈠1、官能团的显色反应－特殊基团的反应2、光谱法－特征吸收3、色谱法－保留行为4、生物学方法－抗菌能力㈡检查1、影响产品稳定性的检查项目－水份、酸碱度等2、控制有机和无机杂质的检查项目3、与临床安全性密切相关的检查项目－异常毒性、热原等4、其他检查项目－其他共存组分㈢含量或效价测定1、微生物检定法比浊法管碟法－抑菌圈效价:是指每ml或每mg中含有某种抗生素有效成分的多少U/mg是以抗生素对微生物的杀伤或抑制程度为指标来判断效价的一种方法方法灵敏度高、需用量少适用范围广－纯品、不纯品、已知的和新的可一次测定同类型抗生素的总效价－无需分离纯化与临床的应用要求一致操作繁琐、费时费力误差较大是结构复杂和多组分抗生素效价测定的首先方法优点㈢含量或效价测定1、微生物检定法缺点

2、物理化学法

HPLCLC-MSUV

容量法准确可靠、专属性高、操作简单、省时、样品用量少1、对结构已知或提纯的抗生素2、需要标准品对照仪器分析方法㈢含量或效价测定第二节β-内酰胺类抗生素β-内酰胺类抗生素6-氨基青霉烷酸（6-APA）；青霉素类；7-氨基头孢菌烷酸（7-ACA）；头孢菌素类；一、结构及分类氢化噻嗪环氢化噻唑环阿莫西林

（羟氨苄青霉素）头孢羟氨苄㈡理化性质1、酸性与溶解性2、旋光性3、紫外吸收特性4、不稳定性酸性一、结构特点与性质Na与碱金属(Na+、K+)成盐

（一）羧基

易溶于水

与有机碱(普鲁卡因)成盐

难溶于水普鲁卡因青霉素（二）手性C

头孢菌素类

C6C7青霉素类C3C5C6

旋光性﹡﹡﹡﹡﹡

（三）共轭体系

头孢菌素类母核有共轭体系

青霉素类母核无明显UV

多数有苯环取代基

UV（四）β–内酰胺环的不稳定性

水溶液

不稳定

干燥纯净

稳定

不稳定性因素四元环张力大

酰胺键易水解

含水量纯度

青霉素类

某些氧化剂酸、碱、青霉素酶（某些金属离子）（温度）降解失效（四）β–内酰胺环

与含水量和纯度密切相关青霉素的降解途径青霉素的降解产物青霉噻唑酸－青霉素酶青霉酸－强酸性环境青霉烯酸－弱酸性环境青霉醛－强酸性-加热青霉胺－强酸性-加热/青霉素酶-重金属降解产物二、鉴别反应（一）显色反应1、异羟肟酸铁反应H2NOHHClC2H5OH（红、棕、褐）2.茚三酮反应

α-氨基-氨基茚三酮蓝紫色烯醇式茚三酮酮式茚三酮缩合蓝紫色+H2OCNCH2RC=ORCHH2NCOOHOC=COCOCOHNH2CCOCOCOCOHCNCCOCOCOCOHCHRNCCOCOCO3.双缩脲反应似肽键（开环分解）-内酰胺类碱性酒石酸铜紫红色紫红色4.与重氮苯磺酸反应橙黄色重氮苯磺酸--56OHHC（偶合）酚羟基头孢哌酮1.K+、Na+的火焰反应（二）各种盐的反应

焰色→鲜黄色

+醋酸氧铀锌→↓黄

Na+

焰色→紫色

+0.1%四苯硼钠→↓白

K+色谱法（三）1、TLC法对照品对照法2、HPLC法光谱法（四）1、UV法样品、分解产物Cu2+头孢氨苄λmax=262nm青霉素V钠

A280nm/A264nm=1.30～1.502、IR法3180cm-1N-Hβ–内酰胺C=O1780cm-13470cm-1O-H1690cm-1仲酰胺C=O1250cm-1C-O以阿莫西林为例三、杂质检查

药物

检查项目

检查方法

头孢他啶聚合物HPLC法

头孢曲松钠

头孢哌酮钠

头孢噻肟钠

头孢呋辛酯有关物质和异构体HPLC法

头孢氨苄有关物质反相TLC法

青霉素钾（钠）吸收度紫外分光光度法

1.头孢他啶聚合物的测定分子排阻色谱法

固定相：葡聚糖凝胶G-10

流动相A：3.5%硫酸铵的0.01mol/L磷酸盐缓冲液

流动相B：0.01%十二烷基硫酸钠

对照品溶液：头孢他啶对照品100µg/ml

1）系统适用性试验：理论塔板数和拖尾因子用1mg/ml蓝色葡聚糖2000、流动相A测定；重复性用对照品溶液、流动相B测定。

N不低于900，拖尾因子0.75~1.5，峰面积的RSD应小于5.0%

2）测定方法

进样供试液，用流动相A；进样对照液，用流动相B。以外标法计算，含头孢他啶聚合物以头孢他啶计不得超过0.3%。2.头孢呋辛酯中有关物质和异构体的检查

异构体异构体A异构体B△3-异构体E异构体控制比例有关物质

3）异构体：

相对保留时间1--被测物

2--标准物异构体相对保留时间判断B异构体0.85供试液谱图中A异构体的峰面积A异构体1.0与A、B异构体峰面积和之比应为0.48~0.55。

异构体A异构体B头孢呋辛酸△3-异构体E异构体E异构体有关物质高低浓度自身对照法（1%）有关物质相对保留时间判断△3-异构体1.2不得大于对照液主峰面积之和的1.5倍（1.5%）E异构体1.7和2.1不得大于对照液主峰面积之和（1.0%）其他杂质不得大于对照液主峰面积之和的1/2（0.5%）所有杂质不得大于对照液主峰面积之和的3倍（3.0%）3.青霉素钠（钾）的吸收度检查：供试液1.80mg/ml，

结果判断：A280不得大于0.10，在264nm处有最大吸收，吸光度应为0.80-0.88.（一）高效液相色谱法原理：利用青霉素类抗生素在一定条件下在反相硅胶上的保留行为的不同而实现高效分离，并与标准品相对照，而对其进行定量的一种方法。优化色谱分析条件（1）Column-CNODSC18C8-Ben（2）mobilephase/flowrate（3）columntemperature（4）detectionwavelength（5）workstationsamplepreparation四、含量测定-容量法和仪器分析法实验注意事项（1）色谱峰要达到较好的分离－基线分离(baseseparation)（2）需要标准品对照，用外标法定量（3）可同时测定多个组分的含量（4）需要排除制剂中辅料等杂质对测定的干扰（二）生物样本中β-内酰胺类抗生素的分析血浆尿样唾液胆汁生物样本色谱柱：HypersilODSC18(200mm×4.6mm,I.D.5μm)样品制备：取血浆200μL，加入内标5μL，再加入HCLO4，窝旋提取InternalstandardIS第三节氨基糖苷类抗生素链霉素双氢链霉素新霉素卡那霉素庆大霉素巴龙霉素链霉素：链霉胍链霉糖N-甲基-L-葡萄糖胺****

糖苷元绛红糖胺+脱氧链霉胺+加洛糖胺

糖一、结构与性质多与硫酸成盐链霉素

3个庆大霉素5个碱性中心碱性（一）水溶性溶解性（二）链霉素

pH5～7.5庆大霉素

pH2～12

稳定稳定性（四）UV（三）链霉素的链霉胍在230nm有UV吸收庆大霉素、奈替米星等无UV吸收坂口反应N-甲基葡萄糖胺反应麦芽酚反应二、

鉴别

茚三酮反应（一）△羟基胺类和α-氨基酸性质+△蓝紫色（二）Molisch试验具有五碳糖或六碳糖结构H+糠醛羟甲基糠醛α-萘酚红紫色蒽酮蓝紫色糠醛与α-萘酚呈色原理红紫色羟甲基糠醛糠醛与蒽酮的呈色原理羟甲基糠醛蓝紫色（三）N-甲基葡萄糖胺反应乙酰丙酮OH-吡咯衍生物（I）对二甲氨基苯甲醛H+樱桃红色（II)（Elson-Morgan反应）新霉素巴龙霉素(缩合)樱桃红色对二甲氨基苯甲醛H+

（4）麦芽酚反应－链霉素的特征反应

H+分子重排麦芽酚链霉素特有反应（或α-萘酚）8-羟基喹啉（五）坂口反应α-萘酚＋8－羟基喹啉链霉胍（六）硫酸盐反应H+盐酸or硝酸不溶（七）色谱法：1.TLC多以硅胶为薄层板，三氯甲烷-甲醇-浓氨水为展开剂，茚三酮或碘蒸汽为显色剂。2.HPLC供试品溶液和对照品溶液的色谱图进行鉴别（八）UV法链霉素在230nm处有紫外吸收。庆大霉素、奈替米星等无紫外吸收。（九）IR法特殊杂质的检查及组分分析（一）链霉素中链霉素B1.来源——发酵过程中产生的甘露糖链霉素2.活性——链霉素的20%-25%3.检查方法——TLC/水解，甘露糖为对照3.色谱条件——薄层板：硅胶G

显色剂：1,3萘二酚-硫酸++410.pH吲哚衍生物巯基醋酸邻苯二醛氨基λmax=330nm衍生化原理

1.(二）庆大霉素中组分C的检查－衍生化后HPLC色谱柱、流动相、检测波长、衍生化条件的摸索。

组分C的毒副作用和耐药性与庆大霉素有差异，导致产品的效价和临床疗效1-烷基硫代-2-烷基异吲哚衍生物RP－HPLC方法

2.规定C125~50%C1a15~40%C2a+C220~50%计算

3.峰面积归一化法四、

含量测定微生物检定法

比浊法、管碟法HPLC法无ＵＶ吸收－不能直接用ＵＶ、荧光检测器

柱前、后衍生化－ＵＶ检测器电化学检测器蒸发光散射检测器第四部分：四环素类抗生素Trtracyclines

TC

理化特性（1）酸碱两性－C4（二甲氨基）、C10（酚羟基）（2）旋光性－含有手性中心（一般为左旋）（3）紫外吸收特性－具有共轭双键体系（吸收波长为长波方向）（4）与金属离子的配位化合物反应－酚羟基和烯醇基（5）不稳定性－对各种外界条件，包括氧化剂、酸、碱，易形成差向、脱水和异四环素，颜色加深弱酸性环境ETC差向四环素强酸性环境ATC脱水四环素碱性环境EATC异四环素差向脱水四环素二、

鉴别试验

浓H2SO4反应（一）黄色朱红色→黄色兰色→黄色紫红色→黄色盐酸多西环素盐酸土霉素盐酸金霉素盐酸四环素42SOH盐酸美他环素橙红色FeCl3反应（二）褐色橙褐色深褐色红棕色盐酸多西环素盐酸土霉素盐酸金霉素盐酸四环素3FeClTLC法（三）盐酸土霉素的鉴别

HPLC法（五）EDTA

克服痕量金属造成的拖尾现象比较保留时间三、

特殊杂质检查

·

4-差向四环素（ETC）

·脱水四环素（ATC）

·差向脱水四环素（EATC）

·盐酸金霉素（CTC）

有关物质（一）HPLC法（2000版）盐酸四环素四环素有关物质TLC图I.供试液(5mg/ml)ETC(0.2mg/ml)

ATC(0.025mg/ml)IV.EATC(0.025mg/ml)CTC(0.1mg/ml)VI.混合液4％0.5％0.5％2％吸收度（二）nmmax355268l、盐酸四环素杂质吸收度

取供试品配成每10mg/ml的溶液至4cm的吸收池中，在530nm处测定，其吸收度不得超过0.12。应严格控制温度和时间四、

含量测定HPLC法

盐酸四环素的测定

系统适用性试验：盐酸四环素、有关