第2章 核酸的结构与功能

Chapter2

Structure&Functionof

Nucleicacid

第二章核酸的结构与功能

2014.9.12

2.1细胞内的遗传物质

2.2DNA螺旋结构及多态性

2.3DNA的非标准二级结构

2.4染色体的结构与组装

2.5RNA的结构与功能

2.6DNA的变性、复性、分子杂交

第二章核酸的结构与功能

2.1细胞内的遗传物质

1)DNA是遗传物质

回顾:

二十世纪四、五十年代，Avery的肺炎球菌转化试验，提出DNA是遗传物质。

A.Hershey和M.Chase噬菌体双标记感染试验,证明DNA是遗传信息的载体。DNA分子的一级结构是DNA分子内碱基的排列顺序DNA分子以密码子的方式蕴藏了所有生物的遗传信息.4

DNA分子碱基序列表面上似乎不规则，实际上高度有序。

任何一段DNA序列都可反映它高度的个体性或种族特异性。分子生物学研究已经证实，DNA控制了生物的遗传性状。无论DNA或RNA，都是由许许多多个核苷酸连接而成的生物大分子，而每个核苷酸又由磷酸、核糖和碱基3部分组成。

DNA真核细胞基因组的最大特点是它含有大量的重复序列，而且功能DNA序列大多被不编码蛋白质的非功能DNA所隔开。所谓C值，通常是指一种生物单倍体基因组DNA的总量。C值反常现象（C-valueparadox）不断增加的生物体的复杂度导致相应基因数量的增加？果蝇基因总数13500线虫18500拟南芥28000人30000RNA切割作用可以保证从单个基因产生多个蛋白质产物。生物的复杂性同其基因组的大小之间几乎没有相关性。2.2DNA的结构1.DNA的一级结构

DNA又称脱氧核糖核酸，是deoxyribonucleicacid的简称，它是一种高分子化合物，其基本单位是脱氧核苷酸。在DNA分子中，磷酸和脱氧核糖是不变的，而4种含氮碱基即腺嘌呤（A）、鸟嘌呤（G）、胞嘧啶（C）和胸腺嘧啶（T）是可变的。在DNA分子中，嘌呤永远与嘧啶配对，而且腺嘌呤（A）只能与胸腺嘧啶（T）配对，鸟嘌呤（G）只能与胞嘧啶（C）配对。如一条链上某一碱基是C，另一条链上与它配对的碱基必定是G。碱基之间的这种一一对应的关系叫碱基互补配对原则。真核细胞DNA序列可被分为3类1、不重复序列在单倍体基因组里，这些序列一般只有一个或几个拷贝，它占DNA总量的10%～80%。不重复序列长约750～2000bp，相当于一个结构基因的长度。蛋清蛋白、蚕的丝心蛋白、血红蛋白和珠蛋白等都是单拷贝基因。

2、中度重复序列

这类序列的重复次数在101～104之间，占总DNA的10%～40%，如小鼠中占20%，果蝇中占15%，各种rRNA、tRNA以及某些结构基因如组蛋白基因等都属于这一类。组蛋白基因：

组蛋白基因在各种生物体内重复的次数不一样，但都在中度重复的范围内。

基因组中存在大量重复序列用以编码组蛋白是有其重要意义的。DNA复制时，组蛋白也要成倍增加，而且往往在DNA合成一小段后，组蛋白马上就要与其相结合，这要求在较短的时间内合成大量的组蛋白，因而需要有大量的组蛋白基因存在。

3、高度重复序列——卫星DNA

只存在于真核生物中，占基因组的10%~60%，由6~100个碱基组成，在DNA链上串联重复高达数百万次。因为卫星DNA不转录，其功能不详。它们是异染色质的成份，可能与染色体的稳定性有关。

研究DNA一级结构意义：阐明遗传物质结构,功能,表达,调控.DNA几乎是所有生物遗传信息的携带者，是信息分子，携带

两类遗传信息:1)负责编码蛋白质氨基酸组成的信息及编码RNA的信息,

这类信息中，DNA一级结构与蛋白质一级结构及RNA一级结构间基本上是共线性关系。2）与基因信息表达有关，负责基因活性的选择性表达，这部分DNA参与复制、基因的转录、翻译、细胞分化等功能。在细胞周期的不同时期、个体发育的不同阶段、不同器官、组织、以及不同外界环境下，决定基因开启或关闭，开启量多少。DNA一级结构的重要意义不仅在于它以密码子方式蕴藏了遗传信息，而且还决定了DNA二级结构和空间结构。从DNA结构与遗传学功能的关系上看，从一级结构中得到的许多信息都需要用二级结构和空间结构进行解释;此外,大量的遗传特征需从二级和空间结构上挖掘，所以二级和空间结构已成为弄清生命遗传奥秘的主要研究领域之一。2.3DNA的二级结构DNA的一级结构是指4种核苷酸的连接及其排列顺序，表示了该DNA分子的化学构成。DNA不仅具有严格的化学组成，还具有特殊的高级结构，它主要以有规则的双螺旋形式存在。在生物活体中，不论DNA的二级结构还是高级结构，都是时刻变化的。DNA的二级结构是指两条多核苷酸链反向平行盘绕所生成的双螺旋结构。通常情况下，DNA的二级结构分两大类：一类是右手螺旋，如A-DNA和B-DNA；另一类是左手螺旋，即Z-DNA。2.4DNA螺旋结构及多态性大量研究表明，DNA结构并非固定不变，它的某些区段因功能需要和特定的nt序列而呈现特殊结构，如三螺旋和四螺旋。这些DNA结构虽然形态各异，但都以一级结构为基础，都具有重要的生物学意义。1）B-DNA：

Watson&Crick阐述的DNA纤维结构即为B-型结构（构象）。结构受环境影响,

DNA钠盐在较高湿度(92％)纤维结构是B-DNAB-DNA含水量高，是大多数DNA在细胞中的Conformation.

29大沟和小沟

由于每种碱基对占据的空间不对称，且脱氧核糖中连接碱基的每一个C1′并不正好处在螺旋的相对位置上（碱基和主链之间的键偏离螺旋直径）使双螺旋骨架的两股链在螺旋轴上的间距不相等，因此，在螺旋分子表面形成了宽窄不等的大沟和小沟。分子生物学第二章核酸的结构与功能30大沟(majorgroove)宽(2.2nm)小沟(minorgroove),宽(1.2nm)。由于空间位阻较小，大沟比小沟能携带更多的与蛋白识别并结合的信息，即大沟中的碱基种类差异易于识别，对蛋白质识别并结合于双螺旋结构上的特异序列区域非常重要。分子生物学第二章核酸的结构与功能只有在沟内，蛋白质才能“感觉”到不同碱基顺序，相反，在双螺旋结构的主链骨架上基本没有信息，故蛋白质与骨架的相互作用呈非特异性，只有与沟内碱基相互作用，才呈现出蛋白质与双链DNA的特异性作用。在人工合成的12聚体中，组成碱基对的两碱基分布并非同一平面，而是沿长轴旋转一定角度，形状像螺旋桨叶片，称螺旋桨扭曲(propellertwisting)。分子计算发现这种构象能提高碱基堆积力，结构更稳定。2）DNA螺旋结构多态性（polymorphism）Polymorphism即不均一性，多样性研究发现DNA分子存在一种以上的双螺旋结构类型。实际上，DNA能以多种螺旋形式存在，包括天然及人工合成，这一现象称：DNA结构多态性大多数DNA都以B型存在，但不是一成不变.

细胞内双螺旋结构是动态可变的，DNA具有构象变化的性质是其发挥功能的前提，这种变化范围可从B型双螺旋结构参数的微小改变到双螺旋分开形成单链。产生多态性的主要原因：多核苷酸链骨架含大量可转动单键及单键转动时所带动基团的移动，当所存在细胞环境改变时，这些构象间可发生相互转化。在每一种构象家族中，参数还有轻微变化。如：A型、C型等的右手螺旋构象和Z型的左手双螺旋构象。A型DNA当相对湿度75%，或脱水、钠盐变为钾盐、铯盐，及由于加入乙醇或盐类使水的活度降低时，DNA由B型→A型。A-DNA也是右手双螺旋，但螺体粗短，碱基对与中心轴的倾角为19°但B-DNA为1°。当nt中脱氧核糖构象变化，则同股链中相邻磷酸基间距缩短0.1nm，这一变化使每股螺旋的碱基对数目由B-DNA的10（溶液中10.5）转变为A-DNA的11。

A型与B型的另一差异：碱基对在螺旋中的位置B-DNA碱基对集中于螺旋轴；A-DNA碱基对向大沟方向移动0.5nm，使两种构象的外型不同。由于RNA分子有2＇-OH基，且核糖C2′羟基采取C3′内式构象，有利于形成A-DNA

所以RNA双链区及DNA-RNA杂交分子和RNA-DNA双螺旋区域都以A-DNA构象存在。

Z-型DNA（左手螺旋）

在研究Oligo-dCGCGCG六聚体晶体X-射线衍射后，发现DNA还存在Z-型（Z-DNA）是左手双螺旋。Z-DNA基本重复单位是嘌呤-嘧啶，嘧啶的苷键——反式取向嘌呤的苷键——顺式取向而右手螺旋中，苷键构象都是反式，因此，是嘌呤苷键构型的不同产生了左手双螺旋。

Z-型链骨架中磷原子和脱氧核糖的连接呈锯齿形，故称Z型。已证明Z-DNA参与了基因表达的调控，调控基因的启闭。因Z-DNA的形成，使局部DNA双链处于不稳定状态，利于DNA双链解开，而DNA解链是DNA复制和转录的必要环节。Z-HelixDNA二级结构中左手螺旋——

Z-DNA的研究B-DNA是最常见的DNA构象，A-DNA和Z-DNA可能具有不同的生物活性。Z-DNA调控基因转录的两个模式在邻近调控系统中，与调节区相邻的转录区被Z-DNA抑制，只有当Z-DNA转变为B-DNA后，转录才得以活化。3）DNA的非标准二级结构和高级结构（构象）反向重复序列

invertedrepeat

指双链DNA中有些区段，含有两个结构相同，但方向相反的序列（按确定方向阅读双链中每条链序列都相同）。

5′GGTACC3′3′CCATGG5′

每条链从5′→3′方向阅读时序列都是GGTACC即：有二重对称性。

这种结构要求DNA互补链中的每一条都可发生链内互补，故具有链内形成发夹结构Hairpin或双链内形成十字形结构cruciformstructure的倾向.反向重复序列大多是限制性核酸内切酶的识别序列。EcoRI含两个相同亚基二聚体，结合在DNA识别位点上：

TCGCGAATTCGCGGCGCTTAAGCGCT当有Mg2+在时，EcoRI在特定位点切割DNA。S1核酸酶能特异切断DNA分子局部单链区。可用来鉴定这类结构。4）三股螺旋DNA当双链中的一条链为全嘌呤链，另一条链为全嘧啶链时，DNA能转化成三链结构triplexHoogsteen1963年提出DNA三螺旋结构理论。三螺旋中的第三股链可来自分子间或分子内。根据第三股链的组成和糖环构型分不同类型。（1）分子内DNA三螺旋在一条自身回折的寡嘧啶与寡嘌呤螺旋大沟内结合了第三股寡核苷酸。第三链碱基与原螺旋Watson-Crick碱基对中嘌呤形成Hoogsteen配对第三链与寡嘌呤核苷酸间同向平行。

绞链DNA是一种分子内折叠形成的三螺旋。当DNA一段多聚嘧啶或多聚嘌呤序列为镜像重复时，即回折产生H-DNA，如交替出现的T和C序列，其互补链为重复的A和G序列，就可能形成H-DNA结构。

（2）分子间的DNA三螺旋结构一定条件下，单链脱氧核苷酸能插入DNA螺旋大沟特定区域，通过氢键形成局部分子间DNA三螺旋结构。（3）平行的DNA三螺旋结构指三螺旋中第三条链的序列与DNA第一条链的序列相同，方向也相同。这种结构因与基因重组recombination有关，称R-DNA。5）DNA的四链结构(G-quarter)X衍射发现，polyG能采取四螺旋构象，螺旋单元是鸟嘌呤的四联体，4个G有序排列在一个近正方形片层中，相邻碱基间G-G氢键相连，形成首尾相接的环形，以螺旋方式堆积而成，每片层含4个G，分别来自4条多聚G链。1989年，Sundpuist等模拟一种原生动物棘毛虫端粒DNA时，人工合成了一段DNA，发现在一定条件下模拟的富-G单链DNA可形成四链体DNA，推测染色体端粒尾的单链之间也形成了四链DNA。

富-G的DNA序列多见于一些在功能上及进化上都相当保守的基因组区域：研究表明，富-GDNA链所形成的G4－DNA可能是作为分子之间相互识别的元件之一。在细胞中起特殊作用。

举例：端粒DNA是四链DNA

线性染色体DNA的3'-端有几百个类似AGGGTT（人）；GGGGTT（四膜虫）；酵母G1-4T，G1-8A的序列；特点:4个G通过配对形成分子内或间的四螺旋，依赖于环境有不同构象。′端粒酶：一种核糖核蛋白酶，催化端粒中重复单位的延长，从而延长端粒的3'-端。

在无限增殖的真核细胞（如癌细胞）中调节端粒丢失与端粒DNA从头合成之间的平衡。科学家把端粒称为“生命之钟”，因为所有的细胞每分裂一次，端粒就缩短一点。当端粒短到不能再缩时，细胞就无法继续分裂而死亡。“如果端粒缩短了，细胞就会老化。相反，如果端粒酶的活动显著，端粒的长度也就能得以保持，并且细胞衰老也将延后。癌细胞就是一个例子，癌细胞被认为是具有永久生命力的。相反，某些特定的遗传疾病会出现，一些有缺陷的端粒酶这样的特征，导致细胞受到损害。这一发现有助于新的治疗措施的发展。端粒被称作“生命时钟控制器”，如果未来人类找到了它的控制开关，人类或能实现“青春常驻”。2.4DNA的高级结构DNA的高级结构是指DNA双螺旋进一步扭曲盘绕所形成的特定空间结构。超螺旋结构是DNA高级结构的主要形式，可分为正超螺旋与负超螺旋两大类，它们在特殊情况下可以相互转变，如负超螺旋拓扑异构酶溴乙锭拓扑异构酶溴乙锭松驰DNA正超螺旋ThestructureofsupercoilsDNA的高级结构是指DNA双螺旋进一步扭曲盘绕所形成的特定空间结构。超螺旋结构是DNA高级结构的主要形式，可分为正超螺旋与负超螺旋两大类。研究细菌质粒DNA时发现，天然状态下该DNA以负超螺旋为主，稍被破坏即出现开环结构，两条链均断开则呈线性结构。在电场作用下，相同分子质量的超螺旋DNA比线性DNA迁移率大，线性DNA又比开环的DNA迁移率大，以此可判断质粒结构是否被破坏。超螺旋类型：①负超螺旋（缠绕不足时产生）右手反时针方向，主要存在于螺旋内部。②正超螺旋（过度缠绕产生）右手顺时针方向，在螺旋基础上进一步扭曲产生。超螺旋性质：1.Tm升高，例：多瘤病毒DNA的超螺旋Tm´=140℃，正常Tm值：85~95℃。2.粘度降低，沉降速度加快，

由于结构紧密，在凝胶电泳中的迁移率比松弛形分子加快，随着卷曲量的增加，迁移率逐渐减慢，可分割形成电泳带。超螺旋DNA的生物学功能：1.超螺旋结构致密易向核内组装。2.超螺旋结构影响双螺旋的解旋能力，从而影响DNA分子与其它分子间的相互作用。生物体超螺旋大多数是负超，与DNA复制、转录、重组、修复有关。例：DNA复制起始时分子中的负超有助于起始因子结合到特定部位，起始复制，负超的保持主要依赖于拓扑异构酶。

拓扑异构酶拓扑学：是数学的一个分科，研究形状或图象逐一连接转化时，保持不变的形状图象的数学特征。在真核和原核生物细胞中，都有催化双螺旋DNA的超螺旋化，或回到松弛状态的酶，称为拓扑异构酶，它能引起拓扑异构反应，使拓扑异构体之间相互转化。

无论拓扑异构酶催化反应的形式怎么不同，都与DNA链的切断与缝合有关。根据作用机理不同分为Ⅰ型和Ⅱ型拓扑异构酶。Ⅰ型拓扑异构酶（topoⅠ）特点：a.仅切断双链DNA中的一条链，催化瞬时的链断裂和再连接反应，连接数改变1.b.无需ATP供能，不催化需能的超螺旋化。

c.使高度超螺旋DNA松弛（染色体DNA是超螺旋化的）。拓扑异构酶生物功能：

1.恢复在细胞增殖过程中产生超螺旋如双螺旋在复制时被解开，在复制叉前面产生正超，转录过程也导致聚合酶前面产生正超，在酶后产生负超等。2.防止DNA过度超螺旋，使其保持在稳定状态。适当的超螺旋对DNA结构和与其它分子相互作用有影响，主要是：①调节复制起始；②保持基因稳定；③促进重组；④抑制有丝分裂。研究细菌质粒DNA时发现，天然状态下该DNA以负超螺旋为主，稍被破坏即出现开环结构，两条链均断开则呈线性结构。在电场作用下，相同分子质量的超螺旋DNA比线性DNA迁移率大，线性DNA又比开环的DNA迁移率大，以此可判断质粒结构是否被破坏。质粒的3种构型：超螺旋的共价闭合环状DNA(covalentlyclosedcircularDNA，简称cccDNA)开环DNA，即共价闭合环状质粒DNA有一条链断裂，(opencircularDNA，简称ocDNA)线状质粒DNA，即质粒DNA在同一处两条链都发生断裂(linearDNA，简称lDNA)。由于这3种构型的质粒DNA分子在凝胶电泳中的迁移率不同，因此通常抽提的质粒在电泳后往往出现3条带，其中超螺旋质粒DNA泳动最快，其次为线状DNA，最慢的为开环质粒DNA。

2.5RNA的结构与功能细胞内RNA功能主要是参与蛋白质生物合成。20世纪80年代揭示了RNA功能多样性。从大的方面讲，概括其主要功能如下：①作用于RNA转录后的加工与修饰；②参与基因表达的调控；③具有生物催化剂的功能；④遗传信息的加工与进化。

核心作用：基因表达的信息加工和调节。2)RNA也是遗传物质

低等生物如某些病毒和噬菌体也采用RNA作为遗传物质。

尽管RNA的化学结构与DNA不同，但仍发挥与DNA相同的功能。不同的病毒，复制机制的细节不同，但基本原理一样，都通过其互补链的合成来实现。人类免疫缺陷病毒（HIV）侵入宿主T淋巴细胞，其中绿色部分为T淋巴细胞，红色粒子为HIV病毒颗粒

由两条单链正链RNA组成，每个RNA基因组约为9.7kb（从外到内：外膜蛋白，内膜蛋白，外壳蛋白，核衣壳蛋白+RNA，颗粒为反转录酶）采用RNA作为遗传物质的某些病毒：1

RNA的种类细胞核内的RNA统称为nRNA，组分十分复杂。nRNA由两部分组成：一是核内mRNA、tRNA和rRNA的初始转录混合物二是核内小分子RNA(smallnuclearRNA，snRNA)mRNA、tRNA和rRNA各自的前体是其各基因的初始转录物。如：mRNA的前体是蛋白质编码基因的初始转录产物，统称核不均一RNA(hnRNA)。RNA既是信息分子，又是功能分子。生物功能的多样性归纳:1.RNA在遗传信息的翻译中起决定作用rRNA在蛋白质生物合成中起装配和催化作用，催化肽键形成的肽基转移酶活性由大亚基rRNA催化。tRNA起转运和信息转换的作用，mRNA起信使和模板作用。2.RNA具有重要的催化功能和其他持家功能。自然界存在的核酶多数催化分子内反应，是RNA合成后加工的一种方式，包括自我切割、自我拼接、自我环化等。催化分子间反应的核酶通常都与蛋白质结合，形成核糖核蛋白复合物。从这些复合物中分离RNA，有些单独即具催化活性，如RNaseP中的MlRNA。2023/2/5分子生物学第二章核酸的结构与功能72

3.RNA转录后加工和修饰依赖于各类小RNA

和其蛋白质复合物。

RNA转录后加工包括:切割、修剪、修饰、异构、附加、拼接等。各类小RNA和其蛋白复合物或选择加工部位，或完成加工反应，这些RNA常与蛋白形成复合物RNPs。2023/2/5分子生物学第二章核酸的结构与功能73

4.RNA对基因表达和细胞功能具有重要调节作用。反义RNA(antisenseRNA)可通过与靶部位序列互补结合，或直接阻止其功能，或改变靶部位构象而影响其功能。1995年发现线虫中一些小RNA能够关闭有关基因的表达，与植物中已知的“基因沉默”相似，由此认识到基因功能可因RNA干扰(RNAinterference，RNAi)而受调节。

2023/2/5分子生物学第二章核酸的结构与功能74基因沉默由双链RNA介导，在两个水平上发挥作用，一是在转录水平，抑制相应基因转录，称转录基因沉默(TGS)；二是在转录后，结合并引起特异mRNA降解，称转录后基因沉默(PTGS)。

2001年在人和鼠细胞中也发现RNAi作用，将它看成是生物界广泛存在的基因调节方式。2.5.2RNA简要分述

1)mRNA

回顾：真核细胞mRNA的基本结构属于有编码功能的mRNA非编码mRNA

近年来发现了一类非编码mRNA，与传统mRNA一样，可进行剪接和3ˊ端加尾修饰，但不具有典型开放阅读框架(ORF)。广泛分布于从果蝇到人类，非编码mRNA的基因位于染色体重要功能位点。非编码mRNA具有明显生物功能，参与许多生理过程，如胚胎发育、肿瘤形成和抑制、细胞生长和分化、染色体失活等近年提出：非编码mRNA是“调控RNA(ribo-regulator)”概念。

细胞内有特殊功能的RNA核酶

(Ribozyme)Ribozyme的催化功能与其空间结构密切相关已知有多种核酶结构：

RNaseP的RNA亚基(M1RNA)

锤头型发夹型丁型肝炎病毒(HDV)基因组反基因组

Varkud卫星(Vs)质粒类型I和Ⅱ自我剪接内含子microRNA

microRNA又称微小RNA，是指植物和动物细胞中自然产生的一类长度为18~25bp的小分子RNA。1993年，VictorAmbros等在秀丽隐杆线虫中发现，基因lin-4不编码蛋白质，它的转录产物中有一个长度为22nt的miRNA。2001年，来自美、德等国的3个不同研究小组通过大规模克隆与功能研究，揭示了这些小分子RNA在动植物体内的调控作用，至此才被命名为microRNA。2002年，这3个小组分别报道从模式植物拟南芥中发现了miRNA，之后在动植物体内被大量发现和克隆。目前从拟南芥和水稻中发现的miRNA已逾200种。miRNA的基因来源于染色体非编码蛋白区的一段，有自身编码基因，位于基因间或内含子区，由长约75bp的茎环结构前体RNA被DicerRNase酶切而成。miRNA在哺乳动物体内的功能：与特异性mRNA的3’-UTR碱基配对，通过阻止这些mRNA的翻译来实现沉默基因的表达，或导致目标mRNA降解。miRNA能通过NorthernBlot被检测。1997年，普鲁西纳朊病毒prion朊病毒是蛋白质病毒，只有蛋白质而没有核酸的病毒。合成朊病毒所需的信息，有可能是存在于寄主细胞之中的;蛋白质指导下的蛋白质合成;朊病毒致病的“蛋白质构象致病假说”.朊病毒(prion)2.5真核生物染色体及其组装1.真核生物染色体（Chromosome）细胞周期大部分时间染色体以染色质形式存在。结构随生长周期改变，间期染色质是松散的纤维状细丝，由核小体成串排列而成，并充满整个细胞核。一旦复制完成染色质高度浓缩成染色体。

2.1染色体2.1.1染色体—遗传物质的主要载体染色体在遗传上起着主要作用,因为亲代能够将自己的遗传物质以染色体（chromosome）的形式传给子代，保持了物种的稳定性和连续性。Thenucleusofanondividingcell(interphase)isfilledwithadiffusematerialcalledChromatin,socalledbecauseearlymicroscopistsfoundthatitstainedbrightlywithcertaindyes.摘自:Lehninger,3rd,p35ChromatinconsistsofDNAandproteinsboundtightlytogetherandisthesubstanceofthechromosomes,whichdonotcondenseandbecomeindividuallyvisibleuntilthecellisreadytodivide.染色体包括DNA和蛋白质两大部分。同一物种内每条染色体所带DNA的量是一定的，但不同染色体或不同物种之间变化很大，人X染色体有1.28亿个核苷酸对，而Y染色体只有0.19亿个核苷酸对。2.2真核细胞染色体的组成作为遗传物质，染色体具有如下特征：①分子结构相对稳定；②能够自我复制，使亲子代之间保持连续性；③能够指导蛋白质的合成，从而控制整个生命过程；④能够产生可遗传的变异。2.3.蛋白质

染色体蛋白主要分为组蛋白和非组蛋白两类。

真核细胞的染色体中，DNA与组蛋白的质量比约为1：1。DNA、组蛋白和非组蛋白及部分RNA组成了染色体。

组蛋白真核生物染色质含5种组蛋白：H1，H2A，H2B，H3，H4，H5含量丰富，富含碱性Arg或Lys。组蛋白在不同物种中具高度保守性。H4最保守，其aa序列在大鼠、猪、牛中完全一样，与碗豆相比102个aa中只相差2个。某些物种精子染色质含鱼精蛋白，而不是组蛋白。

组蛋白具有如下特性：1、进化上的极端保守性不同种生物组蛋白的氨基酸组成十分相似。牛、猪、大鼠的H4氨基酸序列完全相同，与豌豆序列相比也只有两个氨基酸的差异。2、无组织特异性只有鸟类、鱼类及两栖类红细胞染色体不含H1而带有H5，精细胞染色体的组蛋白是鱼精蛋白。朱玉贤，《现代分子生物学》，高等教育出版社；赵亚华，《分子生物学教程》，科学出版社；孙乃恩，《分子遗传学》，南京大学出版社；阎隆飞，分子生物学》，中国农业大学出版社；李振刚，《分子遗传学》，科学出版社；沈羽非，《真核基因表达调控》，北京高等教育出版社；Lewin,B,GenesVII,OxfordUniversityPress；TurnerP.C.etal.MolecularBiology,ScienceExpress；WeaverR.MolecularBiology,ScienceExpress。3、肽链上氨基酸分布的不对称性碱性氨基酸集中分布在N端的半条链上，而大部分疏水基团都分布在C端。碱性的半条链易与DNA的负电荷区结合，而另外半条链与其他组蛋白、非组蛋白结合。4、存在较普遍的修饰作用，如甲基化、乙基化、磷酸化及ADP核糖基化等修饰作用只发生在细胞周期的特定时间和组蛋白的特定位点上。按形态和功能不同，染色质分两类：常染色质(euchromatin)异染色质(heterochro-matin)。2.1.2.染色质和核小体由DNA和组蛋白组成的染色质纤维细丝是许多核小体连成的念珠状结构。

2.6DNA的变性、复性、分子杂交1）DNA的变性

双链DNA中配对碱基的氢键不断处于断裂和再生状态中，稳定性较低的富含A-T的区段更明显。

双螺旋DNA熔解成单链的现象称DNA变性。隐藏在双螺旋内部的发色团，变性后成为单链露出，使DNA物化性质变化，包括：

1.DNA溶液粘度下降

2.沉淀速度增加，浮力密度上升

3.紫外吸收光谱变化

4.生物活性丧失紫外吸收光谱变化是检测变性的最简单方法。

核酸在260nm有强吸收峰，表示为A260nm

吸收光的量取决于核酸分子结构

结构越有序，吸收的光越少。游离的核苷酸比单链RNA和DNA吸收更多的光，而单链RNA或DNA的吸收又比双链DNA分子多。三者的A260nm数值如下：

双链DNAA260nm=1.00

单链DNAA260nm=1.37游离碱基、核苷酸A260nm=1.60（以50ug/mlDNA溶液在A260下测定）DNA变性主要因素：【维持DNA双螺旋结构的主要是氢键和碱基堆积力,凡破坏这两种力的因素都可使螺旋解链变性】

使DNA变性的主要因素有：

加热（生理温度以上）极端pH值有机溶剂：尿素，甲酰胺等加热使DNA变性后，天然DNA和变性DNA的紫外吸收值相差34%左右，吸收值增加的中点称熔解温度。RNA的Tm较复杂，双链RNA的Tm与DNA相近。单链RNA内的双螺旋区域有限，因此变性性质和变化程度不及DNA，其Tm较低、变性曲线较宽。2023/2/51062）DNA的复性

变性DNA在一定条件下重新恢复双链的过程称复性。复性必须满足二个条件：

①高离子强度，以弱除两条链中磷酸基团间排斥力，通常在0.15-0.50mol/L的NaCl的条件下进行复性；②较高温度，可破坏随机形成的无规则氢键，但太高，不能形成有效氢键和维持稳定的双螺旋。2023/2/5分子生物学第二章核酸的结构与功能107影响复性速度的因素：1.分子简单如多聚dC-多聚dG变性后彼此容易发现互补链，可很快复性。真核生物DNA序列复杂，同样条件下寻找互补链时间长，复性速度慢。序列越复杂，所需时间越长，速度越慢因此，复性与DNA分子的复杂性有关。复性是个缓慢过程，限速步骤是互补链之间的精确碰撞。2.DNA浓度同种DNA浓度越高，互补链碰撞机会越多，复性速度加快。3.DNA片段长度片段长的线状分子扩散受到妨碍，减少发现互补链的机会。因此，复性时要将DNA剪切成400bp大小的片段，增加复性速度。2023/2/5分子生物学第二章核酸的结构与功能1084.温度,复性温度不宜过低，一般最佳温度在Tm－25℃。【正常Tm：85-95℃】。5.阳离子浓度溶液阳离子浓度能降低负电荷DNA链间排斥。通常盐浓度高，复性速度快。复性主要依靠两链的碱基间氢键和碱基疏水性堆积作用，电荷存在不利于复性。因此盐离子造成的屏蔽作用有利于复性，但只在小于0.4mol/L浓度时，才与盐浓度有关。为比较不同DNA复性能力，规定复性实验的标准条件：

400核苷酸长度；

Tm-25℃的温度；阳离子强度0.18mol/L。

科研中用3种方法测定DNA复性程度：

①

减色效应，可跟踪A260的O.D值；②用S1核酸酶水解,将样品完全或部分水解，测定抗

S1核酸酶水解的量。③羟基磷灰石柱层析

羟基磷灰石是一种磷酸钙盐，经一定处理后，具有吸附双链DNA的能力，只允许单链DNA通过，从而可间接以算出剩余双链DNA的量。2023/2/5分子生物学第二章核酸的结构与功能110分子杂交指亲缘关系相近不同来源的DNA单链或DNA单链与RNA单链间通过碱基互补形成杂交分子的过程。类型：1.溶液杂交（solutionhybridization）指将不同来源的DNA变性后，在溶液中进行杂交。2.滤膜杂交（filterhybridization）用硝酸纤维素制成的滤膜，可吸附单链DNA或RNA，将变性DNA或RNA吸附到膜上再进行杂交。2023/2/5分子生物学第二章核酸的结构与功能111

利用滤膜杂交已有几种不同目的杂交法：

Southernblot(1975年E.Southern

发明)

鉴定DNA的杂交方法

Northernblot用于RNA研究方面的分析

Westernblot

是专门针对蛋白质的分析鉴定技术。如蛋白质与蛋白质以其配体的亲和反应，抗原-抗体反应等。

经过凝胶电泳分离的DNA分子，都必须通过毛细管或电导作用按其在凝胶中的位置原封不动地“吸印”转移到滤膜上，因此，核酸杂交也被称为“DNA印迹杂交”。由于该方法是E.M.Southern首先设计出来的，所以又叫做Southernblot。Southernblot原理：是将待检测的DNA样品固定在固相载体上，与标记的核酸探针进行杂交，在与探针有同源序列的固相DNA的位置上显示出杂交信号。应用：遗传病检测、DNA指纹分析和PCR产物判断。标记物标记物应具备的条件：

（1）标记后的探针的分子结构要尽可能与原来的分子结构相同，绝不影响其碱基配对特异性，不影响探针分子的主要理化特性，尤其是杂交特性。（2）标记探针的检测方法简便、省时、准确可靠、重复性好、灵敏度高。（3）稳定性好、环境污染少、价廉。杂交

预杂交(加入杂交液，放入42℃杂交炉中，鲑鱼精DNA100℃加热变性5min，迅速加到杂交瓶中，使其浓度达到100μg/ml。继续杂交4hr

)。杂交(倒出预杂交的杂交液，换入等量新的已升温至42℃的杂交液，同样加入变性的鲑鱼精DNA。将探针100℃加热5min，使其变性，迅速加到杂交瓶中。42℃杂交过夜。WesternBlot

原理：经过SDS分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检察电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。实验步骤：蛋白样品的制备；经过SDS分离样品；分离的蛋白转移到膜载体上，转移后首先将膜上未反应的位点封闭起来以抑制抗体的非特异性吸附；用固定在膜上的蛋白质作为抗原，与对应的非标记（一抗）结合；洗去未结合的一抗，加入酶偶联或放射性同位素标记的二抗，通过显色或放射自显影法检测凝胶中的蛋白成分。（1）RNA的完整性。（2）转膜完全。（3）探针标记的效率、变性。（4）防同位素污染。（5）压片曝光时间。NorthernBlot

2.7DNA限制图谱DNA的限制图谱:DNA限制酶切片段沿染色体或染色体片段的DNA长链上依次排列的顺序。DNA限制酶：RestrictionEndonuclease限制性DNA内切酶，是一类能识别双链DNA分子中特异核苷酸序列的DNA水解酶。物理图谱物理图谱：有关构成基因组