纯化与精制-沉淀法

1.2.4纯化与精制沉淀法通过加入某种试剂或改变溶液条件，使生化产物以固体形式从溶液中析出的分离纯化技术称为固相析出分离技术无定形态沉淀：杂乱无章的相互碰撞形成较大颗粒有规则的形态结晶：同种分子或离子相互聚集形成有规则的形状1.沉淀定义利用沉淀剂使所需提取的生化物质或杂质在溶液中的溶解度降低而形成无定形固体沉淀的过程。沉淀和结晶本质上同属一个过程，都是新相析出的过程，两者的区别在于构成单位的排列方式不同，晶体的原子、离子或分子排列是规则的，而沉淀是不规则的。沉淀和结晶通常被统称为固相析出技术。第一节沉淀法概述2.沉淀特点优点：操作简单、经济、浓缩倍数高缺点：针对复杂体系而言，分离度不高、选择性不强；杂质含量高3.应用范围（1）抗生素、有机酸、氨基酸等小分子（2)蛋白质、酶、多糖、多糖等大分子盐析法

有机溶剂沉淀法等电点沉淀法选择性变性沉淀法离子型聚合物沉淀法聚电解质沉淀法高价金属离子沉淀法4.沉淀法分类一.盐析法1.原理1.1基本概念盐析：在高浓度的中性盐存在下，蛋白质（酶）等生物大分子物质在水溶液中的溶解度随盐浓度的升高会急剧下降，并产生沉淀，这种现象称为盐析。盐溶：在低盐浓度下，蛋白质的溶解度随盐浓度的升高，溶解度略有上升，这种现象称为盐溶。第二节蛋白质沉淀方法2.盐析机理示意图①盐离子与蛋白质分子争夺水分子，降低了用于溶解蛋白质的有效水量，减弱了蛋白质的水合程度，破坏了蛋白表面的水化膜，导致蛋白质溶解度下降；②盐离子电荷的中和作用，使蛋白质溶解度下降；盐析的机理3.盐析公式-沉淀基础(1）Cohnx经验公式S—蛋白质溶解度，mol/L;I—离子强度c:离子浓度；Z：离子化合价β，Ks—常数图1碳氧血红蛋白的溶解度与硫酸铵离子强度的关系图β－盐浓度为0时，蛋白质溶解度的对数值。与蛋白质种类、温度、pH值有关，与盐无关；Ks—盐析常数，与蛋白质和无机盐的种类有关，与温度、pH值无关。（2）β和Ks的物理意义Ks盐析法(分级沉淀）：在一定pH和温度下，改变体系离子强度进行盐析的方法；β盐析法(分级沉淀）：在一定离子强度下，改变pH和温度进行盐析； 其中，Ks盐析法由于蛋白质对离子强度的变化非常敏感，易产生共沉淀现象，因此常用于提取液的前处理。而β盐析法由于溶质溶解度变化缓慢，且变化幅度小，因此分辨率更高，常用于初步的纯化。（3）盐析的方法3.1选用盐析用盐的几点原则盐析作用要强盐析用盐需有较大的溶解度盐析用盐溶解度受T影响小盐析用盐必须是惰性的来源丰富、经济3.盐析用盐的选择3.2一般的规律为在相同离子强度下，盐的种类对蛋白质溶解度的影响有一定差异：半径小的高价离子的盐析作用较强，半径大的低价离子作用较弱（Ks）磷酸钾>硫酸钠>硫酸铵>柠檬酸钠>硫酸镁3.3常用的盐析用盐硫酸铵：离子强度大，盐析作用强；溶解度大（767g/L），对T不敏感；分级效果好，对蛋白有稳定作用，价廉；具腐蚀性且缓冲能力差，硫酸钠磷酸盐柠檬酸盐4.影响盐析的因素(1)溶质种类的影响：(2)溶质浓度的影响：蛋白质浓度大，盐的用量小，共沉作用明显，分辨率低；蛋白质浓度小，盐的用量大，共沉作用小、分辨率高(3)pH值：影响蛋白质表面净电荷的数量通常调整体系pH值使其在pI附近；且pr稳定性好(4)盐析温度-常温一般在高盐浓度下，温度升高，其溶解度反而下降5.硫酸铵盐析操作（1）固体加入法：以少量多次方式缓慢加入硫酸铵，其用量由表可得。如：现有20ml料液，饱和度为20％，以加固体硫酸铵的方式盐析，需要达到的硫酸铵饱和度为40％，问需要加入多少固体硫酸铵？盐析饱和度（Saturation）的概念：以硫酸铵为例：250C时，硫酸铵的饱和溶解度是767g/L定义为100%饱和度。（50％饱和度？）25℃硫酸铵水溶液由原来的饱和度达到所需饱和度时，每升硫酸铵水溶液应加入固体硫酸铵的克数（2）加饱和硫酸铵溶液V-加入体积；V0－原液体积S3－所加硫酸铵的饱和度S2－需要达到的硫酸铵的饱和度S1－原液硫酸铵的饱和度二.有机溶剂沉淀法1.概念：在含有溶质的水溶液中加入一定量亲水的有机溶剂，降低溶质的溶解度，使其沉淀析出。2.有机溶剂沉淀的特点（1）分辨率高；（2）溶剂容易分离，并可回收使用；产品洁净；（3）容易使蛋白质等生物大分子失活；（4）应注意在低温下操作；（5）成本高3.原理：（1）降低了溶质的介电常数，使溶质之间的静电引力增加，从而出现聚集现象，导致沉淀。（2）由于有机溶剂的水合作用，降低了自由水的浓度，降低了亲水溶质表面水化层的厚度，从而降低了亲水性，导致脱水凝聚－破坏水化膜。（3）加有机溶剂后，pr等分子的空间结构可能发生变化，使内部疏水基团部分外露，并与有机溶剂的疏水基团结合成疏水层，从而使蛋白沉淀。4.常用的有机溶剂及其选择介电常数要小致变性作用要小毒性要小、挥发性适中水溶性要好（与水无限混溶）4.1选择原则4.2常用的有机溶剂沉淀剂（1）乙醇：沉淀作用强，挥发性适中，无毒常用于蛋白质、核酸、多糖等生物大分子的沉淀；（2）丙酮：沉淀作用更强，用量省，但毒性大，应用范围不广；（3）甲醇介电常数小，60%乙醇的介电常数是48；丙酮的介电常数是22；容易获取5.影响有机溶剂沉淀的主要因素（1）温度－预冷低温有利于防止溶质变性；有利于提高收率（溶解度下降）；（有机溶剂溶于水放热）（2）搅拌速度－散热（3）溶液pH值：目标蛋白与杂质带有相同的电荷，pI附近；稳定性好（4）离子强度:离子强度低有利于沉淀，0.01－0.05mol/L（5）样品浓度:0.5－2%稀：溶剂用量大，回收率低，但共沉淀作用小浓：节省溶剂用量，共沉作用强，分辨率低三.等电点沉淀1.概念： 调节体系pH值，使两性电解质的溶解度下降，析出的操作称为等电点沉淀。2.原理： 蛋白质是两性电解质，当溶液pH值处于等电点时，分子表面净电荷为0，双电层破坏和水化膜变薄，由于分子间引力，形成蛋白质聚集体，进而产生沉淀。3.等电点沉淀实例①从猪胰脏中提取胰蛋白酶原：胰蛋白酶原的pI＝8.9，可先于pH3.0左右进行等电点沉淀，除去共存的许多酸性蛋白质(pI=3．O)。工业生产胰岛素(pI＝5.3)时，先调pH至8.0除去碱性蛋白质，再调pH至3.0除去酸性蛋白质(同时加入一定浓度的有机溶剂以提高沉淀效果)。②碱性磷酸酯酶的pI沉淀提取：发酵液调pH4.0后出现含碱性磷酸酯酶的沉淀物，离心收集沉淀物。用pH9.0的0