PCR技术原理及实验操作-2012年

PCR理论基础及基本操作李静2012.2.21第一节PCR技术聚合酶链式反应PolymeraseChainReaction

PCR的基本原理PCR的成分PCR的操作步骤一、PCR的基本原理和步骤基本原理－DNA复制碱基互补配对原则A=T，G=C一级结构的文字式缩写基因TGCAGGTTAAAGG它的互补链:ACGTCCAATTTCC(误)CCTTTAACCTGCA(正)3’-ACGTCCAATTTCC-5’(正)A—TG—CAAA-TA-TA—TC—GC—GG—CG—CA—TTTA—TG—CC—GA-TA-TA—TC—GG—CG—CA-TA—TG—CT—AC—GT—AA-TA-TA—TC—GG—CG-C二、PCR的成分

模板（TemplateDNA）引物（Primer）

TaqDNA聚合酶

dNTP

Taq聚合酶缓冲液（TaqBuffer）

所有成分在同一离心管中模板是一段单链或者双链DNA，提供用于进行PCR扩增的原始信息对模板的纯度要求低，但不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白等模板浓度过高会导致非特异性扩增增加模板DNA应该尽量保持低温保存引物一段短的单链DNA片段，可结合在核酸链上与之互补的区域，其功能是作为核苷酸聚合作用的起始点，DNA聚合酶可由其3′端开始合成新的核酸链引物浓度过高易导致模板与引物错配，反应特异性下降

；浓度过低产物量少TaqDNA聚合酶

以DNA为复制模板，从将DNA由5'端点开始复制到3'端的酶。DNA聚合酶的主要活性是催化DNA的合成（在具备模板、引物、dNTP等的情况下）及其相辅的活性。必须一直保存于－20℃，内含甘油保存最适反应温度72℃，即延伸温度在配制PCR体系的最后加入酶量增加使反应特异性下降；酶量过少影响反应产量dNTP脱氧核糖核苷三磷酸的缩写，是包括dATP,dGTP,dTTP,dCTP,dUTP等在内的统称，即合成新的DNA链的材料4种dNTP

的浓度相等浓度过高易产生错误碱基的掺入，浓度过低则降低反应产量Buffer

维持Taq酶扩增的最适条件和稳定性Mg2+是TaqDNA聚合酶的激活剂过高:非特异扩增增加

过低:使Taq酶活性丧失，反应产物减少注意事项所有的PCR体系都应该在-20℃保存除了ddH2O之外，完全融化之后再加入，以免影响浓度配制反应体系应在冰上操作或快速进行，以减少非特异性扩增体系配制完成之后应马上进行PCR反应分装处理，专人专用，防止交互污染三、PCR的步骤三个步骤

变性(denaturation)-高温下将模板DNA双链打开

退火(annealing)-引物在较低温度下以共价键结合到模板DNA互补部位

延伸(extension)-Taq酶作用下，不断向引物3’端添加DNTP，DNA链不断延伸反应液中含有所有成分，以温度变化来控制反应阶段：变性94度，退火58度，延伸72度。1234522557294时间（min）温度（℃）适温延伸3高温变性1低温退火2重复1~3步25~30轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性DNA变性形成2条单链子链延伸DNA加倍PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点1234522557294时间（min）温度（℃）适温延伸3高温变性1低温退火2重复1~3步25~30轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性子链延伸DNA加倍DNA变性形成2条单链模板DNA95℃变性第一轮扩增PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点58℃引物1引物2DNA引物退火PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点引物1引物2DNA引物72℃Taq酶Taq酶延伸PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点第1轮结束95℃第2轮开始PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点50℃TaqTaqTaqTaq72℃PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点72℃第2轮结束PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点模板DNA第1轮扩增第2轮扩增第3轮扩增第4轮扩增第5轮扩增第6轮扩增PCR的特点PCR反应条件PCR过程PCR的特点灵敏度高皮克(pg=10-12)量级扩增到微克(ug=10-6)水平能从100万个细胞中检出一个靶细胞病毒检测的灵敏度可达3个RFU细菌检测的最小检出率为3个细菌简便、快速一次性加好反应液，2～4小时完成扩增扩增产物一般用电泳分析对标本的纯度要求低血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等组织的粗提DNAPCR的反应体系标准的PCR反应体系

10X扩增缓冲液：5μl模板DNA:0.1~2μg

引物：各0.2~1μmol/L4种dNTP:各200μmol/LMg2+:1.5mmol/LTaqDNA聚合酶：2.5UddH2O补齐

总体积：50μl可以按照比例放大或者缩小体系，不同的PCR反应需要优化按照实验方案进行即可PCR实验的设计除实验样品外，每个PCR反应都必须有阳性和阴性对照-针对模板阳性：验证PCR反应体系和条件的正确性阴性：验证PCR反应有无污染PCR循环参数94℃，3min；

94℃，45s；

58℃，1min；循环30次

72℃，1min；

72℃，10min；

16℃保温（热力学参数）1234522557294时间（min）温度（℃）适温延伸3高温变性1低温退火2重复1~3步25~30轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性DNA变性形成2条单链子链延伸DNA加倍94℃，3min；

94℃，45s；

58℃，1min；循环30次

72℃，1min；

72℃，10min；

16℃保温

94℃预变性，3min

使DNA双链完全打开退火：58℃，1min

温度由引物长度和GC含量决定。

增加温度能减少引物与模板的非特异性结合，降低温度可增加反应的灵敏性。变性：94℃变性，45s

使双链DNA解链为单链延伸：72℃，1min

温度为Taq酶最适反应温度72℃

时间由扩增片段的长度决定1min扩增1KB

循环次数：

主要取决于模板DNA的浓度

次数过多：扩增效率降低

错误掺入率增加第二节凝胶电泳

(gelelectrophoresis)电泳概念基本原理Qμ＝

6πrη

μ:迁移率

Q:电荷量

r:粒子半径（分子量）η:介质粘度

电泳的用途分离鉴定纯度测定分子量凝胶电泳的种类琼脂糖凝胶电泳()

聚丙烯酰胺凝胶电泳

琼脂糖凝胶电泳

(agarosegelelectrophoresis)

分离核酸原理操作要点应用范围（一）分离核酸原理

电荷效应

分子筛效应

分子构象1.电荷效应核酸是两性电解质

pH=3.5,正电荷pH=8.0~8.3

,负电荷，向正极移动在电泳缓冲液中，DNA带负电荷，在电场作用下向正极移动电泳不能使用蒸馏水，必须使用电泳缓冲液2.分子筛效应小分子移动快，大分子移动慢3.分子构象闭环超螺旋>线状DNA>开环DNA

+-（二）操作要点支持物凝胶浓度的选择

DNA分子量标准电泳缓冲液样品制备电泳条件

DNA电泳染色1.支持物-琼脂糖琼脂糖是由1，3连接的B-D-半乳呋喃糖和1，4连接的3，6脱水α-L-半乳呋喃糖相间联结而成。琼脂中除琼脂糖外，尚含有琼脂糖果胶(Agaropectin)和丙酮酸等带电荷基团分子，在琼脂糖制备过程中尽可能地去除掉这些带电荷分子，以便获得品质优良的电荷中性产品。商品化的琼脂糖西班牙琼脂糖agrose与细菌培养用琼脂agar的区别2.凝胶浓度的选择凝胶的制备注意：使用电泳缓冲液进行配制；加热过程中要不时摇动，使附着于壁上的琼脂糖颗粒进入溶液溶解。3.DNAmarker上样3μl，750bp条带为50ng，其它25ng上样3μl，500bp条带为50ng，其它25ngDNA长度标准曲线4.电泳缓冲液

Tris-乙酸(TAE)pH8.0

Tris-硼酸(TBE)pH8.0

Tris-磷酸(TPE)pH8.0凝胶制备时一定要使用电泳缓冲液

5.样品制备DNA样品每条带>100ng上样缓冲液50%甘油/蔗糖0.5%溴酚蓝/二甲苯青作用：上色；沉降

点样6.电泳条件恒压电泳

低压:1~2V/cm

中压:8~10V/cm

高压：>几十V/cm温度：15~25℃

7.电泳染色溴化乙锭(ethidiumbromide,EB)荧光基团，在紫外光下显色紫外灯下显色Pipetman移液器（枪）的使用法国Gilson德国Eppendorf芬兰Dragon工欲善其事必先利其器根据实验需要选择合适量程的移液器在该过程中，千万不要将按钮旋出量程，否则会卡内部机械装置而损坏了移液枪。卡紧的标志是略为超过O型环，并可以看到连接部分形成清晰的密封圈用大拇指将按钮按下至第一档，然后慢慢松开按钮回原点。接着将按钮按至第一档排出液体，稍停片刻继续按按钮至第二档吹出残余的液体。最后先将移液器从液体中取出，后松开