DNA加合物检测技术

DNA加合物检测技术和方法1、DNA加合物：一般是指外源或者内源的亲电性的化合物或其代谢产物与亲核性的DNA大分子发生反应而生成的共价加合物，是DNA损伤的一类重要形式。2、可与DNA发生加合作用的化学物质:烷化剂，多环芳烃，苯乙烯氧化物，醌类，醛类，抗肿瘤药物，黄曲霉素，N-亚硝基化合物,杂环芳香胺和丙烯酰胺等。其中的一些化合物具有较强的亲电性，可直接与DNA的碱基反应生成加合物，如醛类化合物；另外一些化合物需要经过体内的代谢酶活化，产生具有亲电性，活泼的代谢物，进而与DNA的碱基反应形成共价的复合物，即DNA加合物3、研究DNA加合物的意义：DNA加合物是一类极其重要的生物标志物作为接触（暴露）生物标志物，反映致癌物到达靶位的实际接触剂量，为监测及分析致癌性化学污染物的暴露提供有效手段；作为一种效应标志物，反映DNA受到的损伤效应，为生物体的癌症风险评价提供重要信息。4、检测DNA加合物的技术水平生物体内DNA加合物的含量非常低，大约为每108个核苷酸中含有

0.1～1个加合物；要求所发展的DNA加合物检测方法的灵敏度应该在每108个核苷酸中能检测出1个加合物的水平上。5、目前主要的DNA加合物检测方法：32P-后标记法免疫毛细管电泳激光诱导荧光法免疫分析法液相色谱串联质谱法毛细管电泳串联质谱法6、32P-后标记法32P-后标记法以其高灵敏度（1个加合物/109个核苷酸的水平），低样品（1-10ug）用量且支持空白对照，不需事先制备加合物标样的优点在DNA加合物的检测中占据了重要地位。它不仅能检测DNA加合物，还能检测多种形式的DNA损伤，是目前应用最为广泛的DNA加合物检测方法。6.1原理：(1)采用DNA水解酶将DNA降解为3’-磷酸单核苷酸;(2)在T4多核苷酸激酶的作用下将[γ-32P]ATP

上的32P标记到单核苷酸的5’端,形成可放射显影的5’-32PNp3’(正常单核酸)或5’-32PXNp-3’(含加合物的单核酸)(3)采用多维薄层色谱(TLC)或高效液相色谱(HPLC)分离正常的单核苷酸与含加合物的单核苷酸;(4)对分离得到的含加合物的单核苷酸通过放射自显影技术制成指纹图,液闪计数测定所含加合物的含量。6.2标准的32P-后标记法基本步骤DNA加合物样品的制备DNA加合物的提取和纯化32P-后标记过程加合物的分离与分辨自显影和定量6.3标准的32P-后标记法具体步骤6.3.1DNA加合物样品的制备动物：用雌性大鼠(SD),采用腹腔注射的施药方式,将有毒物溶液注入大鼠的腹腔中,24h后采集动物各组织样品,迅速冷冻贮存于低温冰箱中.人体：静脉血样，取待测人群中某时某人的静脉血5ml(加抗凝剂)，尽快(24h之内)提取全血中的淋巴细胞(或白细胞),贮于一70℃的低温冰箱内.6.3.2DNA加合物的提取和纯化

动物组织

人血淋巴细胞

组织细胞匀浆

淋巴细胞匀浆加蛋白酶温育45min(37℃)用Sevay(氯仿/异戊醇,V/V,24/1)溶剂提取三次依次用饱和酚、酚/Sevay(V/V:l/1)、Sevay(氯仿/异戊醇,24/1)提取水相用冷乙醇沉淀水相用冷乙醇沉淀用RNAse在37℃下培育1h将粗提的DNA用蛋白酶K培育lh,然后用RNAse酶培育1hDNA浓度用紫外分光光度计测量.6.3.332P-后标记过程DNA和加合物,加一定量外切酶和内切酶,在适量的酶解缓冲溶液存在下培育2-3h,使DNA完全酶解成2’-脱氧核苷3’-单磷酸(3’-dNmP+3’-dXmP)用适当量的P1核酸酶37℃培育40min,以除掉大量正常DNA的酶解物在T4多核苷酸激酶的催化下,γ-32PATP(uCi)和底物(2’-脱氧核苷3’-单磷酸)反应(37℃,30min),生成带放射磷的2’-脱氧核苷3’5’二磷酸酯(3’5’dNDP+3’5’dXDP)最后加1ul的腺苷三磷酸酶37℃下培育30min,除掉多余的放射磷.6.3.4加合物的分离和分辨依据DNA和DNA加合物的酶解物色谱性能的差异标记过的DNA加合物的酶解物样品点在ODS一TLC吸附板上(10×10cm)用相应的展开剂展开,分离加合物与正常核酸将留在ODS板上的加合物接触转移到PEI一TLC阴离子交换板上,用不同的展开剂多次多相的展开,将不同的加合物分离分辨开.6.3.5自显影和定量将展好的PEI板进行自显影处理,制出DNA加合物的自显影指纹图.然后将相应的PEI板上的多余斑点(与空白对照)取下,液闪计数定量计算,加合物含量用RAL(相对加合物标记率)表示:DNA加合物的自显影指纹图6.432P-后标记法的不足DNA需要经过酶解，操作麻烦，定量准确度差不同种类、不同结构的加合物的标记效率不一样依赖各种色谱法进行分离，分离过程漫长，工作量大，自动化程度低检测的特异性低，难以区分结构类似的DNA加合物6.532P-后标记法的改良方法6.5.1限量ATP法

在标记反应中限制加入ATP的量，由于被加合物的核苷酸优于正常的核苷酸，从而提高了灵敏度。（107-108单核苷酸）6.5.2丁醇富集法

在将DNA样品消化成3’-单核苷酸后，加入丁醇及反相试剂四丁基氯化铵，在酸性的条件下将抽提富集的被加合核苷，然后再进行标记。6.5.3

核酸酶P1/S1富集法

在进行32P标记反应前，用核酸酶P1或S1处理3’单核苷酸，正常3’-单核苷酸可以被核酸酶P1去磷酸化,从而不被T4多聚核苷酸激酶作用,而核酸酶P1不能使加合的核苷酸去磷酸化,这样在进行标记时就只有加合的核苷酸被标记上32