微生物的数量和大小测定2011.9.28

实验4微生物大小和数量测定学习使用镜台测微尺和目镜测微尺在显微镜下测定微生物大小的方法。(一)微生物大小的测定一、目的要求对于病毒、细菌、放线菌、真菌和原生动物等不同类型的微生物来说，它们的大小存在很大的差异。在同一类型中不同种类的微生物，或同一种类中不同时期的微生物个体，它们的大小也存在很大的差异。二、实验原理三、实验器材1、菌种：酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae）2、器材：显微镜、镜台测微尺、目镜测微尺三、实验步骤1、目镜测微尺的校正镜台测微尺有刻度的一面朝上，置显微镜载物台上，先在低倍镜下，将镜台测微尺有刻度的部分移至视野中央。转动目镜使目镜测微尺的刻度与镜台测微尺的刻度平行。利用移动器移动镜台测微尺，使两尺在某一区域内两线完全重合，分别数出两重合线之间镜台微尺和目镜微尺所占的格数。计算40x下目镜测微尺的校正值。目镜测微尺每格长度（um）＝两重合线间镜台测微尺格数×10/两重合线间目镜测微尺格数2、细胞大小的测量酵母菌悬液滴在载玻片上，盖上盖玻片，置显微镜载物台上。用目镜测微尺测量细胞宽和长。三、实验结果计算出目镜测微尺校正结果以及酵母菌大小测定结果四、思考题1、为什么更换不同放大倍数的目镜或物镜时，必须用镜台测微尺重新对目镜测微尺进行校正？2、在不改变目镜和目镜测微尺，而改用不同放大倍数的物镜来测定同一细菌的大小时，其测定结果是否相同？为什么？1、明确血细胞计数板计数的原理。2、掌握使用血细胞计数板进行微生物计数的方法。

(二)微生物数量的测定一、目的要求二、实验原理细胞总数的测定（包括活的和已丧失活力的细菌）1、比浊法2、染色涂片计数法3、显微直接计数法1、比浊法比浊法的原理是利用细菌细胞在溶液中数量越多，浊度越大，在光电比色计中测定时所吸收的光线越多。2、染色涂片计数法取0.01ml的菌悬液放在1cm2的玻片上，让其干燥，然后固定染色，再置显微镜下计数每一视野中的菌数，算出视野面积，按下列公式即可求出每ml原菌液中的含菌数。每ml原菌液中的含菌数=视野中的平均菌数×1cm2/视野面积×100×稀释倍数3、显微直接计数法显微镜直接计数法是将小量待测样品的悬浮液置于一种特别的具有确定面积和容积的载玻片上(又称计菌器)，于显微镜下直接计数的一种方法。显微镜直接计数法的优点是直观、快速。缺点是所测得的结果通常是死菌体和活菌体的总和。目前已有一些方法可以克服这一缺点，如结合活菌染色，微室培养等方法来达到只计数活菌体的目的。

血细胞计数板由四条槽构成三个平台；中间较宽的平台又被一短横槽隔成两半，每一边的平台上各刻有一个方格网，每个方格网共分为九个大方格，中间的大方格即为计数室。计数室是由一个大方格分成25个中方格，而每个中方格又分成16个小方格；共计400个小方格。每一个大方格的面积为1mm2，盖玻片与计数区之间的高度为0.1mm，所以计数室的容积为0.1mm3。计数时，通常在40×下数五个中方格的总菌数，然后求得每个中方格的平均值，以及大方格中的总菌数，再换算成1ml菌液中的总菌数。(1ml=?mm3)１个计数室＝１×１mm包含５×５个中方格１个中方格＝４×４个小方格三、实验器材

1、菌种：酿酒酵母2、器材：显微镜、血球计数板等四、实验步骤1—显微直接计数法

1、在10×和40×下找到计数室。2、盖上盖玻片将摇匀的酿酒酵母菌（或大肠杆菌）悬液由盖玻片边缘滴一小滴，让菌液沿缝隙靠毛细渗透作用自动进入计数室。如滴入过多，溢出并流入两侧槽内，使盖玻片浮起，体积改变，会影响计数结果，需用滤纸把多余的溶液吸出，以槽内没有溶液为宜。如滴入溶液过少，经多次充液，易产生气泡，应洗净计数室，干燥后重做。

3、静止5min（为什么），先用低倍镜将计数室移至视野中央。4、在高倍下计数：每个计数室选5个中格(4个角和中央的一个中格)中的菌体进行计数。对于分布在刻线上的细菌，依照“数上不数下，数左不数右“的原则进行计数。五、实验结果

1、统计五个大格中的细胞数量记数大格12345细胞记数2、计算每毫升酵母菌悬液的细胞数。六、思考题1、根据你的体会，说明用血细胞计数板计数的误差主要来自哪些方面？应如何尽量减少