第13章+细胞的增殖和调控

MathematicalBiosciencesInstitute(OhioStateUniv),2October2003第十三章细胞的周期与调控13.1细胞周期概述13.2MPF13.2.1MPF的发现13.2.2MPF的成分13.2.2周期蛋白13.2.3CDK13.3细胞周期控制13.3.1G1/S13.3.2S/G2/M13.3.3M期的调控13.4细胞周期的模型

1细胞周期的简介由细胞分裂结束到下一次细胞分裂结束所经历的过程，叫细胞周期。分为4个期：–G1期(gap1)，指从有丝分裂完成到期DNA复制之前的间隙时间。–S期(synthesisphase)，指DNA复制的时期。–G2期(gap2)，指DNA复制完成到有丝分裂开始之前的一段时间。–M期又称D期(mitosisordivision)，细胞分裂开始到结束。2001NobelPrizeLelandH.Hartwell1970s“Checkpoint”Yeastgenetics~100CDCgenesStartgeneTimHunt1980sCyclinsSeaUrchinsPaulM.Nurse1970sCDKsyeast13.2MPF(Mphase–promotingfactor),Cyclin,CDK

2.1细胞促成熟因子（MPF）的发现2.2MPF的组成周期蛋白(B)CDK(cyclindependentkinase)1970sRao和Johnson发现与M期细胞(Hela)融合的间期细胞染色体发生凝缩，称为早熟凝集染色体(prematurelycondensedchromosome，PCC)。–G1期PCC为单线状，因DNA未复制。–S期PCC为粉末状，因DNA由多个部位开始复制。–G2期PCC为双线染色体，说明DNA复制已完成。甚至不同类的M期细胞也可诱导PCC产生，说明M期细胞具有促进间期细胞进行分裂的因子，即成熟促进因子(maturationpromotingfactor，MPF)。G1期和M期的衔接2.1MPF的发现S期和M期的衔接G2期和M期的衔接ManfredLohkaandJimMaller(UCHSC) -usedcellfreeassaytopurifyMPF -testedvariouscytosolicfractionsforMPFactivityMPFisa2subunitproteinkinase -32kDaand45kDaMPFMPFCdkMPF的历史PCCM-phaseTriggerMPFP32andP45,kinase非洲爪蟾(1988)Cdcgenefoundin

yeast

P34cdc2triggerG2/MP34cdc2bindwithP56cdc13active

Cyclinfoundinurchin,keyfactorForM-phase(1983)

MPFincludeCdkandcyclinp32=P34cdc2=CDKP45=P56cdc13=cyclinB2.2周期蛋白1983年最先发现G1期:cyclinC,cyclinD,cyclinECln1,Cln2,Cln3(Yeast)M-期:cyclinA,cyclin相对稳定A2DestroyboxCyclinboxB1PEST,G1cyclinrenewalC不同的周期蛋白在不同的细胞周期表达，结合不同的CDK，控制CDK激酶的活性。特点：在细胞周期中呈周期性变化。含有一段约100个氨基酸的保守序列，称为周期蛋白框，介导周期蛋白与CDK结合。有丝分裂中细胞周期蛋白的调控在TimHunt的周期蛋白的研究中阐明了MPF的调控规律

PSTAIREantibodyBindsALLCDK’s2.3CDK

CyclindependkinaseCDKICDKkinasedomainCdk1=cdc2Cdk3cdk8细胞周期控制六、细胞周期检验点（checkpoint）

组成：感受器、信号传导通路、效应器。•主要检验点：–G1/S检验点：DNA是否损伤？细胞外环境是否适宜？细胞体积是否足够大？在酵母中称start点，在哺乳动物中称R点(restrictionpoint)。–S期检验点：DNA复制是否完成？–G2/M检验点：DNA是否损伤？细胞体积是否足够大？–中-后期检验点：纺锤体组装检验点。3.1TheG1/S检验点环境因素生长因子内部因素DNA损伤G1cyclinD(D1,D2,D3),E,AG1CDK,CDK2,4,6cyclinD+CDK4,6cyclinE,A+CDK2cyclinD(D1,D2,D3)iskeyfactorforG1/ScyclinEiskeyfactorforstartups-phaseG1周期蛋白通过泛素结合PEST降解Oringinrecognitioncomplex,复制起始复合物Orc1-6DNAreplication-licensingfactortheoryMinichromosomemaintenanceprotein,Mcm2-73.2S/G2/M

阻止DNA未完全复制时启动M期只有DNA复制正确完成，方可启动未复制完成的DNA会释放一些信号。导致细胞周期运转受阻

CDC25活性低但Wee1活性高，MPF不能活化

MPF失活3.3M期的调控MPF的激活M期检验点MPF和G2检验点MPF-促进细胞通过G2检验点Thr161Tyr14,15PMPF活化M期CDK的激活起始于分裂期cyclin的积累。•结合cyclinB的CDK1被Wee1将Thr14和Tyr15磷酸化而不具有活性，使CDK/cyclin不断积累。•在M期，Wee1的活性下降，CDC25使CDK去磷酸化，去除了CDK活化的障碍。•CDK的激活需要Thr161的磷酸化，它是在CDK激酶(CDKactivatingkinaseCAK)的作用下完成的。Tyr15Inhibitory:AddedbyWee1RemovedbyCdc25Thr160Activating:CDKaddsafterCyclinbindingcyclinB+CDKinactiveWee1/mik1andCDKKinaseActiveCDK14,15amicacidInactivepre-MPFCDK160+p,14.15-pCdc25cWee1/mik1CDKKinaseMPFinducesmultiplenuclearandcytoplasmicchangesattheonsetofMphase,bothbyactivatingotherproteinkinasesandbyphosphorylatingproteinssuchascondensinsandthenuclearlamins.G1SG2MG1G1SG2MG1M期检验点：检验染色体是否连接到纺锤体上。后期促进复合物APC与M期调控APC:AnaphasePromotingComplexM期向后期转换依赖严格调控APC1-8APC调控CyclinB和其他蛋白泛素化降解纺崔体装配检验点控制APC活性Mad2Cdc20周期蛋白降解瑞典皇家科学院6日宣布，将2004年诺贝尔化学奖授予以色列科学家阿龙·切哈诺沃、阿夫拉姆·赫什科和美国科学家欧文·罗斯，以表彰他们发现了泛素调节的蛋白质降解。其实他们的成果就是发现了一种蛋白质“死亡”的重要机理死亡之吻ProteindegradationNeednotenergy,onlyneedenzymeNeedenergy,certaintime,certainpositionandcertaindirectionproteindegradation一种被称为泛素的多肽在需要能量的蛋白质降解过程中扮演着重要角色。这种多肽由76个氨基酸组成，它最初是从小牛的胰脏中分离出来的。它就像标签一样，被贴上标签的蛋白质就会被运送到细胞内的“垃圾处理厂”，在那里被降解。有丝分裂周期蛋白的聚泛素化原来细胞中存在着E1、E2和E3三种酶，它们各有分工。E1负责激活泛素分子。泛素分子被激活后就被运送到E2上，E2负责把泛素分子绑在需要降解的蛋白质上。但E2并不认识指定的蛋白质，这就需要E3帮助。E3具有辨认指定蛋白质的功能。当E2携带着泛素分子在E3的指引下接近指定蛋白质时，E2就把泛素分子绑在指定蛋白质上。这一过程不断重复，指定蛋白质上就被绑了一批泛素分子。HighEnergyThioesterBond,canbetransferredfromE1toE2,E3,orsubstrateUbiquitinisTransferredviaThioesterBondsMitoticCyclinsareDestroyedbyUbiquitin-DependentProteolysisproteosome总结4细胞周期模型YeastSizeandMorphologyThroughtheCellCycle酵母的大小和形态学在细胞周期中特征。Thestagesofmitosisandcytokinesisinananimalcell.在动物细胞中有丝分裂和胞质分裂的不同阶段。出芽酵母Thestagesofmitosisandcytokinesisinananimalcell.

5细胞周期检测方法细胞周期的时间长短与物种的细胞类型有关。通常G1期持续时间差异较大，M期最短约0.5～4.5小时。标记有丝分裂百分率法（percentagelabeledmitoses，PLM）：对测定细胞进行脉冲标记、定时取材、利用放射自显影技术显示标记细胞，通过统计标记有丝分裂细胞百分数的办法来测定细胞周期。放射标记物为3H或者14C标记的TDR。5.1细胞周期时间的测定细胞周期同步化

细胞同步化(synchronization)是指在自然过程中发生或经人为处理造成的细胞周期同步化。（一）自然同步化1、多核体：如：粘菌、疟原虫。2、某些水生动物的受精卵：如海胆、海参、两栖类。3、增殖抑制解除后的同步分裂：如真菌的休眠孢子移入适宜环境后，它们一起发芽，同步分裂。人工同步化

1、选择同步化1）有丝分裂选择法：M期细胞与培养皿的附着性低，振荡脱离器壁收集。–优点：操作简单，同步化程度高，细胞不受药物伤害。–缺点：获得的细胞数量较少（分裂细胞约占1%～2%）。2）细胞沉降分离法：M期细胞体积大，可用离心分离。–优点：可用于任何悬浮培养的细胞。–缺点：