第二章 紫外-可见分光光度法

第二章紫外-可见分光光度法紫外-可见分光光度法属于分子吸收光谱法，主要产生于价电子在电子能级间的跃迁，广泛用于无机和有机物的定性和定量测定。该方法灵敏度高，选择性好，仪器设备价格适中。在分析化学领域中是一种较受欢迎的方法。在介绍分子吸收光谱法之前，先了解一下电磁辐射的性质。§2-1电磁辐射的性质电磁辐射包括无线电波、微波、红外、紫外及X射线和射线等形式。其在真空中的传播速度等于光速：c=·=31010cm/s由光学知识可知，电磁辐射具有波微两重性。

一.波动性光的波动性可用以下的波动性参数来描述。1.周期T相邻两个波峰或波谷通过空间某一固定点所需要的时间间隔称为周期。单位为s。2.频率单位时间内通过传播方向上某一点的波峰或波谷的数目。即单位时间内电磁场振动的次数，称为频率，其值等于T的倒数，单位为Hz。3.波长相邻两个波峰或波谷间的直线距离。不同电磁波谱区可采用不同的单位。用cm、m和nm表示。4.波数波长的倒数，即每cm长度内含有波长的数目，单位cm-1。5.传播速度cc=·单位：cm/s二.微粒性光的微粒性特征为：光由光子组成，而光子具有能量，其能量与波长之间的关系为：E=h·=hc/h—普朗克常数6.626×10-34J·s由上式可知，不同波长的光具有不同的能量，波长愈长，光的能量愈低；反之，则愈高。§2-2分子光谱概述如果某分子吸收了光辐射的能量，其外层电子可从较低能级跃迁至较高能级，但由于分子内部运动的能级变化较复杂，所以分子吸收光谱相对也较复杂。在分子内部除了电子运动外，还存在核间的相对运动，即核的振动和分子绕着重心的转动。如图所示：A、B表示不同能量的电子能级；在每个电子能级中因振动能量不同而分为若干个振动能级；在同一电子能级和同一振动能级中，因转动能量不同而分为若干个转动能级。若用E电、E振、E转分别表示三个能级，则三者的关系为：E电＞E振＞E转。E电约为1~20ev，E振在0.05~1ev之间，E转一般小于0.05ev，由此可算出相应的波长分别为：E电60~1250nm，E振、E转50m~1.25cm。在电子能级发生变化时，往往不可避免地伴随着分子的振动和转动能级的变化。因此分子光谱通常比原子光谱复杂。所以前者的吸收光谱基本位于紫外或可见光区内；后者的吸收光谱则属于红外和远红外区。而分子的总能量E

=E电+E振+E转。由分子光谱可知:•如果用红外光去激发分子，则不足以引起电子能级的跃迁，而只能引起分子的振动和转动能级的跃迁；各种物质的分子对红外光的吸收与其分子结构密切相关，因此红外吸收光谱可应用于分子结构的研究。•物质对不同波长的光具有不同的吸收能力，物质也只能选择性地吸收那些能量相当于该分子内部三种能量总合(E电+E振+E转)的辐射光。由于每种物质分子内部结构的不同，它们的能级千差万别，如此就决定了它们对不同波长光线的选择性吸收。§2-3Lamber-Beer定律一.吸光度和透光度当一束平行光通过均匀的液体时，光的一部分被吸收，一部分透过溶液，一部分被器皿反射。设入射光强度为I0，吸收光强度为Ia，透射光强度为It，反射光强度为Ir，则I0=Ia+It+Ir。在分析时，一般在仪器中放两个相同材料和厚度的器皿分别盛装待测液和参比液，使强度为I0的单色光分别通过两器皿，然后再测量透射光强度，如此可抵消反射光的影响。什么叫透光度？即透射光的强度(It)与入射光的强度(I0)之比称为透光度或透射比。用T表示：T=It/I0不难理解，溶液的透光度，它对光的吸收；反之，则吸收。一般用吸光度A来表示物质对光的吸收程度。其定义为：A=lg(1/T)=lg(I0/It)

实际应用中，T以百分率表示。二.Lamber-Beer定律该定律是光吸收基本定律，也是分光光度分析法的依据和基础。Lamber-Beer定律指出，当入射光波长一定时，溶液的吸光度A是待测物质浓度c和液层厚度b的函数。Lamber和Beer分别于1760年和1852年研究了吸光度与液层厚度、溶液浓度之间的定量关系。Lamber定律指出，当用一定波长的单色光照射某一固定浓度的溶液时，其吸光度与光透过的液层厚度成正比。数学表达式为：A=k·b式中k为比例常数，b为液层厚度。Beer定律指出，当用一定波长的单色光照射厚度一定的均匀溶液时，其吸光度与溶液的浓度成正比。数学表达式为：A=k·c式中k为比例常数，c为溶液浓度。当溶液浓度(c)和液层厚度(b)均可变时，它们都会影响吸光度(A)的数值。合并L和B两式，即得到L-B定律：A=kbc•L-B定律的推导：据量子化理论，光是由光子组成，其能量E=h。

吸收过程就是光子被吸光质点(分子或离子)所俘获，结果使吸光质点能量增加而处于激发态；它们俘获光子的几率与其面积有关。如图所示，假设有一束强度为I0的单色平行光，垂直通过一横面积为s的均匀介质。当光强度为Ix的单色光通过吸收层(db)后，光强度减弱了dIx，则厚度为db的吸收层对光的吸收率为-dIx/Ix，另一方面，由于db为无限小，所以截面积上所有吸光质点所占的面积之和(ds)与横截面积(s)之比(ds/s)可视为该截面积上光子被吸收的几率，即：-dIx/Ix=ds/s如果进一步在吸收介质里含有m种吸光质点，且它们之间没有相互作用，设ai为第i种吸光质点对特定光子的吸收面积，dni为ds中第i种吸光质点的数目，则：代入上式，得到:当光束通过厚度为b的吸收层时，对上式两边积分，得到：根据前述的吸光度A=lgI0/It定义，可得到:将式子中截面积s用均匀介质的体积V和光程b来表示，即：s=V/b代入上式，

NA为Avogadro常数；ni/(NA∙V)即为第i种质点在均匀介质中的浓度(ci)；将0.4343NAai合并为常数k，则：该公式表明：总吸光度等于吸收介质内各吸光物质的吸光度之和。即吸光度具有加和性。这是进行多组分光度分析的理论基础。如果吸收介质内只有一种吸光物质时，公式可简化为:

A=kbc1.质量吸收系数从L-B定律的表达式中可知，k值随c、b所取的单位不同而不同。当c以g·L-1为单位，b以cm为单位时，k可用a来表示，称为质量吸光系数，三.比例常数的表示形式2.摩尔吸收系数如果c以moLL-1为单位，b以cm为单位，此时k称为摩尔吸收系数，用符号表示。单位：L·moL-1·cm-1。的物理意义是：浓度为1moL·L-1，厚度为1cm的溶液，在一定波长下测得的吸光度大小。此时,A=bc。其单位为Lg-1cm-1。此时，A=abc。四.光谱曲线的表示方法将不同波长的光依次通过被分析的溶液，分别测定不同波长下的吸光度或透光度。以波长为横坐标，吸光度或透光度为纵坐标作图，得到的谱图称为该物质的吸收曲线或透光曲线。在紫外-可见光谱法中，纵坐标的参数除了用T%、A表示外，还可用、lg。曲线中具有最大吸收值的波长，称为最大吸收波长，一般用max表示，P.12.图2-3。

吸收曲线描述了物质对不同波长光的吸收能力大小，反映了物质分子能级的变化。所以吸收曲线形状和max的位置以及吸收强度等与分子的结构密切相关。因此，利用吸收曲线可以对物质进行定性分析；而在某一波长下测得的吸光度与物质浓度的工作曲线(A~C曲线)可对物质进行定量分析。为了提高测定的灵敏度，波长往往选择在max处进行。五.光吸收定律发生偏离的原因1.吸光度A的测量在光度分析中，测量A的工作是先配置一系列浓度不同的标准溶液；用容量瓶或比色管来配置，如图。根据L-B定律A=bc，b即为比色皿的厚度，如果实验中使用相同材料和厚度的比色皿，b可视为常数。以测得的A为纵坐标，对应的溶液浓度c为横坐标，将测得的数据作图，所得的曲线称工作曲线。(或称标准曲线，理论上应为一条直线。)但在实际工作中，经常发现该曲线会不成直线，且不过原点；特别当吸光物质的浓度比较高时，曲线有明显地偏离直线现象。关于曲线不过原点的原因在测定过程中，溶液中除了吸光物质吸收入射光以外，含有的其它试剂或离子也可能吸收入射光；另外，在测定过程中，部分光被器皿表面反射而会造成损失。克服的方法通常将试液和空白液分别置于相同材料和厚度的比色皿中，此空白液即称为参比溶液。调节仪器，使参比溶液的A=0，然后再测定其它溶液的A值。

一般通常使用纯溶剂作参比液(即C0溶液)。使用了参比液后，实际上是以通过参比液的光强度作为测定的入射光强度，如此测得的吸光度能比较真实地反映待测物的浓度。(1)由非单色光引起的偏离2.偏离比耳定律的原因L-B定律适用于单色光。但由于仪器中单色器的色散能力及出口狭缝的宽度等，各种分光光度计得到的入射光实际上都是某一波段的复合光。由于物质对不同波长光的吸收程度不同，结果导致曲线负偏离。设一束入射光为含有两个波长max、的复合光,两个波长对应的入射光强度分别为I0和I0，透过光强度为It和It,总入射光强度I0总=I0+I0；总透过光强度It总=It+It；A实=lg(I0+I0)/(It+It)

=lg(It·10bc+It·10bc)/(It+It)=lg10bc[It+It·10(-)bc]/(It+It)=bc+lg[It+It·10(-)bc]/(It+It)=A理+A由于，所以A为负值；A实A理，产生负偏。与的差值及浓度C愈大，则负值A愈大,对光吸收定律的偏离程度就愈严重。实际测得的吸光度为：降低由于单色光不纯造成负偏的方法：•选择吸收曲线的max作入射光波长。因为吸收曲线峰值顶部曲线较平坦，入射光谱带内各波长的值相近。选择max，偏离光吸收定律较小。只有当干扰物质存在并对待测物质的max产生吸收时，才选择没干扰的其它波长作入射光波长。•选择高分辨率仪器，使入射光波长范围尽可能窄。(2)杂散光的影响在光度分析中，杂散光指不包括在入射光带内即不通过吸收池而直接进入检测器的非单色光。其来源有几方面：a.仪器内光学部件及机械零件反射和散射的光；b.外界及光源漏进检测器的光；c.光学系统有缺陷而引起的不均匀散射等；杂散光一般引起负偏离。(3)溶液本身的原因•溶液折射率变化的影响若溶液浓度的变化能显著改变溶液的折射率，则可观察到偏离比尔定律的现象，此时必须对光吸收定律进行折射率(n)校正：A=bc·n/(n2+2)2•散射的影响一般在浓度小于0.01moL/L时，n基本上为常数，其影响可忽略不计，说明Beer定律适用于稀溶液。溶液若为胶体溶液、乳浊液或悬浊液时，在入射光通过溶液时，除一部分被吸光粒子吸收外，还有部分因散射而损失，使透光度减小，A实。所以往往发生正偏离。•化学因素引起的偏离吸光物质常因离解、缔合而形成新化合物或互变异构等化学变化而改变其浓度，导致了偏离。例如K2Cr2O7在水溶液中存在下列平衡：此平衡随溶液酸度及稀释程度不同而左右移动，因而Cr2O72-和CrO42-的浓度比不同。因此在某一波长下，测得的吸光度与铬的总浓度之间的线性关系被破坏。§2-3比色分析法及仪器一.目视比色法

用眼睛去观察、比较溶液颜色深浅以确定物质含量的方法称为目视比色法。该方法将被测溶液在相同条件下和一系列不同浓度的标准溶液进行比较，颜色深浅相同者，则它们的浓度认为相同。推导如下：对标准液和试液则分别有：当溶液颜色相同时，说明I标=I试∵两溶液为同一种物质,则：标=试设液层厚度相等,b标=b试，∴c标=c试操作方法：取一套大小相同的比色管，加入系列标准溶液和相应的显色剂及缓冲溶液，然后稀释至同一刻度，形成颜色由浅至深的标准色阶。另取一大小相同的比色管，加入被测液后按配制标准色阶的方法处理，在管底下方放置一块白板沿比色管中心垂直观察比较颜色。该方法的优点：(1)操作简便，仪器简单，特别适用于工厂里大批样品的分析；(2)因所用的平底比色管较长,可测定颜色淡的稀溶液中的微量物质；(3)该方法准确度不高，相对误差约为5~20%。二.分光光度法1.概述分光光度法原理上不同于目视法，它是比较有色溶液(吸光物质)对某一波长的吸收情况，而目视法是比较透过光的强度。分光光度法是在光电法的基础上发展而来。分光光度法与光电法的基本原理相同，所不同的仅在于两者获得单色光的方法不同。前者采用棱镜或光栅等分光元件，后者采用传统滤光片，利用棱镜或光栅获得的“单色光”纯度要比滤光片高许多。分光光度法中所用的仪器称为分光光度计，它的测量范围不再局限于可见光区域内，可扩展到紫外和红外光区域。对测定而言，单色光愈纯愈好。其纯度一般用半宽度表示，即指透光曲线上，峰高一半时所对应的峰宽度。半宽度，说明透过的单色光就愈纯。分光光度法的特点：(1)因得到的入射光纯度较光电比色法高得多，所以进行测量时，偏离比耳定律的情况大为改善，从而也扩大了测定的线性范围。(2)由于测定波长可任意选定，故在一定条件下,利用吸光度的加和性，可同时测定溶液中两种或两种以上的组分。(3)由于入射光波长范围扩大，测定不仅局限于可见光区域，还可用于紫外光区域，即可测定那些吸收紫外光的无色物质。2.分光光度计用于分光光度法分析的仪器称为分光光度计。根据其波长范围可分为可见分光光度计，紫外-可见分光光度计，红外分光光度计。紫外及可见分光光度计主要应用于含量的测定；红外分光光度计主要应用于结构的分析。其原理的框示图如下：(1)光源可见区光源常用钨灯或碘钨灯，属于热光源；其发射波长约为320~2500nm，除用作可见光源外，还可用作红外光源。紫外光源多为气体放电光源。如氢、氘、氙放电灯及汞灯等。其中以氢灯和氘灯应用最广泛。其发射波长为160~500nm。氘灯发射强度比同样的氢灯大3~5倍。一般仪器上都设置有稳压电源，因为电源电压的变化会引起光源发光强度的波动，从而影响测定结果。(2)单色器将光源发出的连续光谱色散为单色光的装置称为单色器。单色器是利用光的色散原理制成，所谓的色散即是把复合光变成各种单色光的过程。单色器由棱镜或光栅等色散元件及狭缝和透镜组成。棱镜由玻璃或石英制成。因为玻璃吸收紫外光，所以玻璃制的棱镜只能用于可见分光光度计。紫外分光光度计必须使用石英材料的棱镜。狭缝和透镜系统的作用是调节光的强度，控制光的方向并获得所需波长的单色光。光栅是另一种色散元件。当复合光照射到光栅上时，根据光的衍射和干涉原理，色散为不同波长的单色光。近年来，由于光栅刻制技术的发展，使用光栅作为色散元件的分光光度计日益增多。(3)吸收池吸收池是盛装试液并决定液层的厚度，常用的吸收池(比色皿)材料有石英和玻璃两种。石英吸收池可用于紫外-可见及近红外光区，玻璃的只能用于可见及近红外光区。常见的比色皿为长方形，光程有0.5~3cm。同样厚度的比色皿之间透光度相差应小于0.5%。(4)检测器所谓光度检测器就是将紫外-可见光的信号转变为电信号的装置。常用的检测器有光电池、光电管和光电倍增管。它们都是基于光电效应的原理而制成。a.硒光电池的工作原理：当光线照射到光电池上时，半透明膜金属及半导体硒都会吸收光子。金属膜吸收光子后释放光电子，由于硒的半导体性质，使得透明金属层的光电子密度较大，相对来说，光电池的底板成为正极。当照射光强度不大，且光电池外电路电阻小于100Ω时，光电流i=KI。使用光电池需注意几点：受强光照射或长时间连续使用，会产生疲劳现象，即光电流逐渐下降，i与I不成正比。内阻小，与一般直流放大器不相匹配；温度系数较大，使用时要注意隔热，防止光线直射。易受潮，受潮后光电流大小会不正常，甚至引起光电池完全失效。受光照后，硒光电池可产生约100~200A电流。该电流不需放大可直接用灵敏电流计测量。b.光电管的工作原理：光电管在紫外-可见分光光度计上应用较广。构造：以一弯成半圆柱型的金属片为阴极，其内表面涂有一层光敏物质，多采用碱金属或其氧化物，受光照射时，可放出光电子。阳极通常为镍环或镍片，两极密封于玻璃或石英内，抽真空。两极间施加约90v的直流电压。当光线照射到阴极内表面时，光子轰击出阴极表面的电子(即光电子)，此电子在电场作用下流向阳极，形成电流，经测量该电流的大小与照射到阴极上的光强度成正比。与光电池不同，光电管产生的光电流很小，需经放大后才能被测定。根据阴极光敏材料不同，光谱的灵敏区可分为蓝敏和红敏两种。前者在阴极表面沉积锑和铯(Sb-Cs)，可用于波长210~625nm测定，后者在阴极表面沉积了银和氧化铯(Ag-Cs2O-Cs)，可用于波长625~1000nm测定。与光电池比较，它的光敏范围宽，不易疲劳，但灵敏度只有光电池的1/4左右。(5)显示系统其作用是将检测器输出的电信号以吸收光谱的形状(A或T)显示。常用的显示测量仪器有电位计、检流计、自动记录仪及数字显示装置。无机物分析中，很少利用金属离子本身的颜色进行光谱分析。因为其吸光度数值都比较小。§2-4显色反应及显色剂一般选用适当的试剂，与待测离子反应生成对某波长有较大吸收的物质后再进行测定，这种反应称显色反应。所用的试剂称显色剂。应用最多的显色反应为配合反应；此外还有O-R反应，取代反应等。往往同一种物质有数种显色反应，其原理和灵敏度各不相同。可根据具体情况进行选择。一.分光光度法对显色反应的要求2.生成物应组成恒定，稳定性好，显色条件易于控制，保证测量结果有良好的重现性。3.对照性好，显色剂与有色配合物两者的max差别要在60nm以上。选好显色剂后，研究显色反应的条件十分重要，下面介绍影响反应的主要因素。二.影响显色反应的因素1.显色剂用量1.生成物必须在紫外-可见光区有较强的吸光能力，即吸收系数(一般指)较大。为了保证显色反应进行完全，一般需要加入过量的显色剂；但对于有些显色反应，R加入过多，会引起某些副反应，对测定不利。显色剂的加入量通常根据实验结果来确定。显色剂用量对显色反应的影响一般有三种情况：显色反应通常可表示为：M-被测组分，R-显色剂，MR-生成的有色配合物第一种曲线是比较常见的。随着显色剂浓度cR，A。当浓度达到某一数值时，A值趋于平坦；选择显色剂的量可在a、b之间。第二种曲线的平坦部分较窄，即cR，A反而。如：Mo(SCN)32+⇌Mo(SCN)5⇌Mo(SCN)6-

浅红橙红浅红用于测定的化合物应生成Mo(SCN)5，其，A。SCN-的量加入过多，会生成Mo(SCN)6–而使A。∴必须控制cR的量。

第三种曲线与前两种不同，随着cR，A；没有较明显的平坦可选择。∴cR的量需用某个标准液作对比，通过实验确定。酸度在显色反应中的影响是多方面的。2.溶液的酸度(1)多数显色剂都是有机弱酸或弱碱，溶液的pH会影响显色剂的平衡浓度和颜色。一般对其显色反应：M+HR⇌MR+H+增加酸度(pH)对显色反应不利；另外，有些显色剂在不同的酸度下有不同的颜色。(2)影响待测金属离子的存在状态。当溶液pH,大部分金属离子容易水解生成氢氧化物，使溶液颜色褪去，破坏了有色配合物的生成。(3)影响生成的配合物的组成。对于某些金属离子与配位体生成逐级配合的显色反应，酸度不同，配合物的配位数往往不同。如：磺基水杨酸与Fe3+的显色反应，在不同酸度下，可生成1:1、1:2和1:3三种颜色不同的配合物。

pH值范围配合物组成颜色

＜4Fe(C7H4O3)+紫红色(1:1)

4~7Fe(C7H4O3)2-棕橙色(1:2)8~10Fe(C7H4O3)3-黄色(1:3)对于这种情况，应严格控制溶液的酸度。放置时间及温度不仅影响配合物的稳定性，也影响显色反应，一般通过条件试验来确定。3.显色反应的时间、温度4.溶液和溶剂中共存干扰离子的影响在某些显色反应中，如果加入某种有机溶剂，常常会发现降低有色配合物的离解度，提高显色反应灵敏度。而共存离子的影响往往是负面的。如有的本身有颜色或与显色剂生成有色配合物，会使A，造成正干扰；如果干扰离子与被测组分或显色剂生成无色配合物，则会降低被测组分或显色剂的浓度，影响显色剂与被测组分的反应，造成A，引起负干扰。消除干扰离子的方法通常有如下几种：(1)控制溶液酸度；(2)加入掩蔽剂；(3)利用O-R反应，改变干扰离子的价态；(4)利用参比溶液消除显色剂和某些干扰离子；(5)选取适当波长；(6)采用某种分离方法。三.显色剂1.无机显色剂无机显色剂在光度分析中应用不多，主要原因是因为生成的配合物不够稳定，灵敏度和选择性较差。目前应用较多的有：硫氰酸盐：可与铁、钴、钼、钨、铌及铼等元素形成络合物。钼酸铵：在酸性溶液中，可与磷、硅、砷及锗等元素的含氧酸阴离子生成二元杂多酸配合物。如：PO43-及SiO32-与钼酸铵生成黄色的H3PO4·12MOO3及H2SiO3·12MOO3

二元杂多酸。过氧化氢：在酸性溶液中，能与钛、钒、铌、铬、钼及钨等元素形成配合物。2.有机显色剂大多数有机显色剂能与金属离子生成稳定的配合物(螯合形式)，显色反应的选择性和灵敏度都较高，应用范围也较无机显色剂广得多。有机显色剂种类繁多，常用的有偶氮类，三苯甲烷类，醌亚胺类，含肟(RC=NOH)及含硝基类，安替比林类及邻菲啰林类。生成的配合物有些可溶于水中，而有些则溶于有机溶剂中。溶于有机溶剂的可考虑采用萃取方法来进行光度法测定。另外，有机显色剂中一般都含有生色团和助色团。所谓生色团即表示有机显色剂中含有不饱和基团，能吸收大于200nm的光。如：-N=N-，＞C=O,＞C=S，-N=O等。所谓助色团表示结构中含有孤对电子的基团，与生色团的不饱和键相互作用，可以影响有机化合物对光的吸收，往往使颜色加深，吸光度增大。如胺基，羧基等等。3.多元配合物由三种或三种以上的组分形成的配合物。在分光光度法中应用较多的是由一种金属离子与两种配位体所组成的配合物，即“三元配合物”。主要类型有：(1)三元混配配合物适用于配位数较高，容易形成未饱和配合物的金属离子，即如果金属离子与配合剂配合时，第一配合剂的体积较小，且配位数未饱和，就容易与第二配合剂配位。(2)离子缔合物金属离子首先与配合剂生成配阴离子或配阳离子，再与带相反电荷的离子生成离子缔合物。与(1)不同的是金属离子的配位数已经满足，但电荷没有饱和。一般离子缔合物具有疏水性，主要应用于萃取分光光度测定。(3)金属离子-配合剂-表面活性剂体系M与R反应时，如加入某些长链的季胺盐、Op乳化剂等表面活性剂，可形成胶束化合物。§2-5光度测量误差和测量条件的选择一.光度测量误差分光光度法的误差，除了来源于各种化学因素外，还包括仪器的精度、测得的透光率和吸光度的读数误差等，这些可由多方面引起测定误差。而这些胶束化合物的吸收峰有明显的波长红移现象。测定时，灵敏度可显著提高。光度计中，透光率的标尺刻度呈均匀分布，而吸光度A=-lgT，∴导致A的标尺刻度分布是不均匀的。A=-lgTT=100%，A=0T=10%，A=1.0T=0%，A=∞对于同一台仪器，读数的波动对透光率来说，基本上为一定值，但由于A的标尺刻度不是均匀的，所以A的读数波动不为定值；根据标尺可知，A，读数波动引起的误差，因此选择合适的吸光度范围，可减小测量结果的误差。据L-B定律,A=-lgT=bc微分得到:得到:要使测定结果(c/c)的相对误差最小，对上式求导应有一极小值。即：得：A=-lgT=0.4343或T=36.8%说明当A=0.4343时，得到浓度误差最小。通过作图(c/c-T)可进一步了解吸光度测量对结果测量的误差关系。当透光度为15%~65%(吸光度0.2~0.8)时,浓度测量的相对偏差较小;此即分光光度分析中比较适宜的吸光度测量范围.二.测量条件的选择为使测定结果有较高的灵敏度和准确度，必须注意选择适当的测量条件。主要有以下几点：1.入射光波长的选择选择的原则：一般以被测物质的最大吸收波长作为入射光，即所谓的最大吸收原则。在此波长下测定，不仅灵敏度较高，而且测定时偏离L-B定律的程度减小(如前所述)，准确度较高。

如果共存干扰物质在max处也有吸收，应选择待测物有吸收而干扰物无吸收的波长作入射光。即所谓的“吸收最大，干扰最小”的原则。如图，a表示丁二酮肟镍的吸收曲线；b表示酒石酸铁的吸收曲线；用丁二酮肟显色测定钢中的镍，其最大吸收波长在470nm左右；试样中的铁用酒石酸钾掩蔽,在同样波长下，也有吸收，对测定有干扰。从图可知，当波长大于500nm时，干扰变小，所以测定时，可将入射光波长选在500nm以上。虽然灵敏度有所降低，但可消除干扰。2.控制适当的吸光度范围由以上讨论的光度测量误差中得知，为使测量结果的误差尽可能小，一般应控制标准溶液的吸光度在0.2~0.8范围内。从A=bc的公式中可知，控制A值大小可从两个方面进行，一是调节b值；二是改变浓度c。3.选择适当的参比溶液在测量吸光度A时，利用参比溶液调节仪器零点，可消除溶液中其它成份以及吸收池、溶剂对光的反射和吸收所带来的误差。如此根据试样溶液的性质，选择合适组分的参比溶液是很重要的。(1)溶剂参比若样品基体、试剂及显色剂均在测定波长处无吸收，则可用溶剂作参比液(有时用蒸馏水替代)。(2)试样参比若显色剂或溶剂无吸收而样品基体组分有吸收时，则应采用不加显色剂的样品溶液作为参比液。(3)若显色剂、试剂及样品基体均有吸收时，则应在样品溶液中加入适当的试剂，将被测物掩蔽起来，使之与显色剂不再起反应，然后依次加入显色剂及其它试剂，以此作参比液。在光度分析实验中，有时标准曲线不过原点，其重要的原因之一就是参比液选择不当。§2-6定量分析法光度分析法的定量依据是L-B定律，即在一定波长处，被测物的吸光度与其浓度呈线性关系。因此通过测定某溶液对一定入射光波长的吸光度，即可求出该物质在溶液中的浓度和含量。一.标准曲线法(校准曲线法或工作曲线法)该方法是应用最多的一种方法。具体做法：配制一系列不同含量的标准溶液，以不含被测组分的空白溶液为参比液(视具体情况而定)，测定标准溶液的吸光度。绘制吸光度A–浓度c曲线，此曲线即称为标准曲线。在相同条件下，测定未知试液的吸光度，从标准曲线上对应出未知试液的浓度。在建立一个方法时，首先要确定符合L-B定律的浓度范围，即线性范围。定量测定一般在线性范围内进行。

对于常规性的测定，有时往往采用标准对比法。即在相同条件下，测定试样溶液和某标准溶液的吸光度(AX和AS)，由标准溶液的浓度CS可计算出试样中被测物的浓度Cx。使用该方法须在测定的线性范围内，且Cs和Cx较接近时，才能得到较为准确的结果。二.差示分光光度法光度分析法具有简便、快速、灵敏和高选择性等优点。但只适用于测定一定含量的组分。如前所述，当待测组分浓度过高或过低，即吸光度值过大或过小时，测量会产生很大的误差，导致准确度降低。为扩大分析的需求，在普通光度法的基础上，提出了差示分光光度法。该方法扩大了待测物的浓度范围，可获得较满意的测定结果。下面介绍差示法中的一种方法—高吸光度差示法。普通方法之所以不适于测定高浓度的溶液，原因在于：(1)普通法以试剂空白作参比，因待测液浓度较高，C，所以透过的光强度T很小，以至于仪器测量时发生困难。(2)普通法中由于两者A值相差较大，使A或T的读数落在标尺的一端，造成读数的相对误差很大。而差示法是采用一个比被测溶液浓度稍低的标准溶液作为参比溶液。使AX和AS之间的差距缩小；AX可落在准确测量的读数范围之内，克服了一般光度法误差大的不足。其操作方法：当入射光通过一个比试样浓度稍低的参比溶液时，将仪器的透光度调至100%(参比A=0)，然后测定试样的吸光度；用标准曲线法或对比法确定试样浓度。下面讨论差示法的原理：普通法：AS=bCS

AX=bCX

两式相减：AX–AS=b(CX–CS)即：A=bC结论：浓度为CX和CS的两溶液吸光度差A与两溶液的浓度差C成正比。

若以浓度为CS的标准溶液替代普通法的空白溶液作为参比，调节其透光度为100%(A=0)，然后测量待测液的吸光度，得到的是两溶液(CX和CS)吸光度的差值。此差值与两溶液的浓度差成正比。

举例：两个溶液浓度分别为CS和CX，普通法测得TS和TX分别为10%和5%，两溶液的T读数相差5%。差示法中把浓度为Cs的溶液作参比溶液，调节仪器光强度至标尺读数Ts为100%，即把普通法测定中光强度Ts=10%的标准溶液用作差示法中的参比溶液(Ts=100%)，标尺扩大10倍。所以待测液的Tx在差示法中相应的变为5%10=50%，此时两溶液读数差：100%50%=50%。可见在普通法和差示法中，两溶液的透光度比并未改变，但差示法中相当于把刻度读数放大了10倍。这样使待测液的TX从普通法的5%(落在测量误差较大的区域)通过差示法后变为50%(落在测量误差较小的区域)。差示法的测量误差经过推导，得到：C=CX-Cs，T为扩大标尺后的TX值。三.双波长分光光度法对于吸收光谱有重叠的单组分(显色剂与待测物的吸收光谱重叠)或多组分试样(由于性质相近与待测物的吸收光谱重叠)、浑浊试样以及背景吸收较大的试样，由于存在散射和特征吸收，难以找到一个合适的参比溶液来抵消这种影响，可采用双波长分光光度法进行测量。方法：让两束强度相同，波长不同的单色光交替照射于同一吸收液，测量两者的吸光度差值，可消除上述各种干扰，求得待测组分的含量。设波长1和2光强度相等且均为I0，通过吸收池后其透光度的强度分别为I1和I2。据L-B定律：lgI0/I1=A1=1bclgI0/I2=A2=2bc得到吸收液对1和2两波长光的吸光度差值A：

A=A2-A1=lgI1/I2=(2–1)bc上式表明，被测液在两个波长1和2处的吸光度之差与溶液中被测物的浓度成正比，可根据所测得的A求出被测组分的含量。双波长法与普通法相比,其特点是不用参比溶液,而以试液本身对某一波长1的吸光度(A1)作参比。该方法适用于吸收曲线有部分重叠的混合物的分析。这样可避免因试样和参比两个吸收池之间的差异所引入的误差；消除背景吸收及光散射所引起的误差。介绍双波长法的一种应用：等吸收法。如图：在1和2处,2,4,6-三氯苯酚的吸光度相等；若要测定苯酚，以2为测量波长，1为参比波长，则可消除三氯苯酚对苯酚的干扰。∵2,4,6-三氯苯酚在1、2处的A相等，所以：A与cx成正比，与cy无关，即消除了组分Y的干扰。一.有机化合物紫外吸收光谱的产生紫外吸收光谱是有机物分子中价电子的跃迁而产生的。因此，这种吸收光谱决定于分子中价电子的分布和结合情况。§2-7有机化合物的紫外吸收光谱有机化合物分子中有几种不同性质的价电子：形成单键的电子称为键电子；形成双键的电子称为键电子；氧、氮、硫、卤素等含有未成键的孤对电子，称为n电子(或p电子)。按分子轨道理论，两个键合原子的原子轨道结合形成分子轨道时，会形成一个低能级的成键分子轨道和一个高能级的反键分子轨道，即每一个或键轨道必有一个与之对应的*反键或*反键轨道。n电子是非键轨道，所以无对应的反键轨道。当有机物吸收可见-紫外光时，若吸收的光能恰等于某电子基态(、或n轨道)与激发态(*或*轨道)的能级差，则分子中的价电子就会被激发到相应的反键轨道而产生吸收光谱，通常产生的跃迁为*，*，n*，n*。二.跃迁类型n*

实现这类跃迁所需的能量也较高，波长一般位于150~250nm范围内。含溴、碘、硫和氮的化合物n*吸收峰大多在大于200nm的近紫外区，含氟、氯、氧的化合物，n*吸收峰一般在小于200nm的真空紫外区。*它需要的能量较高，一般发生在真空紫外区。饱和烃中的C–C键属于这类跃迁。如甲烷的max=125nm；乙烷为135nm。4.n*在由杂原子直接构成键的基团中，例如-C=O及-C=N等。杂原子上的n电子跃迁到*轨道，发生n*跃迁,在四类跃迁中，n*跃迁能量最小，max最长，吸收强度弱()，100。3.*它需要的能量通常情况下低于以上两种。吸收峰一般位于近紫外区，在200nm左右，如乙烯的最大吸收波长max=162nm；其特点是值较大，max≥104，属强吸收带。由上可知，有机物价电子可能产生的跃迁主要为以上四种类型；且各种跃迁所需的能量各不相同,跃迁能量的大小顺序为：*＞n*≥