第八章 典型发酵过程的特性与工业控制1

发酵工程精品课程http:///jpkc/fjgc华东理工大学·生物工程学院

第八章典型培养过程传统微生物培养重组菌培养动物细胞培养传统微生物培养前面已讲述很多，本章着重在后两方面的介绍典型培养过程http:///jpkc/fjgc第一节基因工程菌培养一、概述基因工程菌生产的主要产品有二类，蛋白质和非蛋白质。非蛋白质产物可以通过代谢工程细胞来获得，这些细胞插入编码酶的DNA，产生新的途径或增强某一途径，从而得到新的化合物或增加产量。现代基因工程重点在蛋白质产物上，主要产品如下：典型培养过程基因工程菌培养http:///jpkc/fjgc细胞因子、疫苗、酶典型培养过程基因工程菌培养http:///jpkc/fjgc产品最主要的用于人的治疗，此外还有用于畜牧业、食品或工业用的生物催化剂。用于注射用的治疗蛋白要求高度纯化，由于病人可能产生的强的免疫反应或副作用是灾难性的。有的蛋白转译后还要进行修饰，如糖基化、磷酸化后才有活性。治疗蛋白最主要的是保证产品的质量和安全，降低成本并不重要，由于这些产品大多用量很小，价格高，附加值高。典型培养过程基因工程菌培养http:///jpkc/fjgc二、宿主-载体系统

构建基因工程菌，必须选择宿主和表达系统，一般希望翻译后的处理要简单，如果用于食品要考虑宿主菌是否列入FDA表中，列入的认为是安全的菌。常用的宿主系统有：大肠杆菌

G+细菌低等真核细胞哺乳动物细胞典型培养过程基因工程菌培养http:///jpkc/fjgc1、大肠杆菌如果产品翻译后不需要修饰，大肠杆菌是最普遍选用的宿主。优点：人们对大肠杆菌的生理学和遗传学背景了解得比其他任何生物深。有利于进行复杂的基因操作；大肠杆菌有相当高的生长速率，并能长到高细胞浓度（50g/l）；大肠杆菌能生长在简单的便宜的培养基上。典型培养过程基因工程菌培养http:///jpkc/fjgc这些因素给大肠杆菌许多经济上的优势。但大肠杆菌不是完美的宿主。主要问题是大肠杆菌分泌(secretion)的蛋白通常在细胞内，当这些蛋白达到高浓度时，会被水解或形成不溶的包含体。其中主要是外源蛋白，但也含有其它细胞物质。包含体中的蛋白是不折叠的，不折叠的蛋白没有生物活性，必须重新溶解并使它复性。大量的外源蛋白的产生会触发热冲击响应。热冲击调节子的一种响应是增加蛋白水解酶的活性。在一些情况下，细胞内蛋白水解酶是使蛋白的降解速率几乎等于产生的速率。典型培养过程基因工程菌培养http:///jpkc/fjgc2、G+细菌枯草杆菌是可替代大肠杆菌的菌种，它是G+菌，它没有外膜，并且能把蛋白分泌（excretion）到胞外。它的这一性质对生产非常有吸引力。然而枯草杆菌有许多问题妨碍它在商业上的采用。主要是枯草杆菌产生大量的蛋白酶，会很快降解产物。而且枯草杆菌基因构建比大肠杆菌困难，质粒稳定性也比较差，所以在使用上有较大的限制，典型培养过程基因工程菌培养http:///jpkc/fjgc3、低等真核细胞酵母菌酿酒酵母是第一个被人利用的生物，它的最大生长速率是大肠杆菌的25%，酵母比最大的细菌大，容易从发酵液中回收。酵母有简单糖基化能力和分泌蛋白的能力。这些是它的优点。但酵母达到高表达水平比大肠杆菌困难，外源蛋白分泌到胞外也有限，现在发展了其他的酵母如甲醇营养型酵母等。当产生是外源蛋白需要复杂的糖基化和翻译后修饰时，低等真核细胞就不能适应，要用动物细胞组织培养来达到。典型培养过程基因工程菌培养http:///jpkc/fjgc4、哺乳动物细胞哺乳动物细胞在表达时有正确的氨基酸排列，而且所有转录后处理与在整个动物中相同，在某种情况下可能转录后修饰有些不同但它可提供最接近于天然副本的产物，此外多数产物可以分泌到胞外。但动物细胞生长缓慢，培养基价格昂贵，蛋白表达水平较低。用于重组DNA生产蛋白的最常用的宿主是CHO（中国仓鼠卵巢细胞）。典型培养过程基因工程菌培养http:///jpkc/fjgc三、利用基因工程菌生产的特点基因工程菌带有外源基因，外源基因可能在质粒上也可能整合到染色体上，这些基因可能不稳定。丢失外源基因的菌往往比未丢失的菌生长快得多，这样就会大大降低产物的表达。为了抑制基因丢失的菌的生长，一般在培养中加入选择压力，如抗生素。基因工程菌的培养一般分两段。前期是菌体生长，生长到某一阶段，加入诱导因子，诱发产物表达。典型培养过程基因工程菌培养http:///jpkc/fjgc四、基因不稳定性生产的目标是得到最大量的外源蛋白，但是大量外源蛋白的形成对宿主细胞是有损害的，通常是致死的，失去制造外源蛋白的能力的细胞一般生长得快得多，从而能替代有生产能力的菌株，这就导致基因的不稳定性。基因的不稳定性原因：分离丢失、结构不稳定性宿主细胞调节突变典型培养过程基因工程菌培养http:///jpkc/fjgc1、分离丢失

当细胞分裂时一个子细胞没有接受质粒就出现分离丢失。质粒可分为高拷贝质粒（>20拷贝/细胞）和低拷贝质粒（有时低到每个细胞一至二个拷贝）。低拷贝质粒有专门的机制保证在子代细胞中有相等的分配，高拷贝质粒通常很少遵循二分法分配到子代细胞。对于高拷贝质粒，几乎所有子细胞接受一些质粒，也有可能有的细胞没有接受质粒，当然形成无质粒细胞的可能性是低的（每百万细胞分裂中一个）。典型培养过程基因工程菌培养http:///jpkc/fjgc但在大的反应器中含有非常多的细胞，总会存在无质粒细胞，例如1000L发酵液，每毫升有109个细胞，总共就有1015个细胞，那么在这个反应器中就含有109个无质粒细胞。质粒的分离丢失可能受许多环境因素影响，如溶氧、温度、培养基组成和恒化器中的稀释速率。许多质粒也会形成多聚体，它是相同质粒附着在一起形成一个单位。典型培养过程基因工程菌培养http:///jpkc/fjgc典型培养过程基因工程菌培养http:///jpkc/fjgc2、质粒结构不稳定性

除了分离不稳定性问题外，某些细胞保留质粒，但质粒结构发生改变，而不产生外源蛋白，减少对细胞的有害影响，这就是结构不稳定性。如果质粒发生突变，仍保留了抗生素抗性基因，但不合成外源蛋白，那么这些突变株仍能在含有抗生素的培养基中生长。而且由于不合成外源蛋白，生长得比原来的工程菌更快，使得在这种培养物中带有改变了的质粒占统治地位的菌，这种培养情况就是结构不稳定性。典型培养过程基因工程菌培养http:///jpkc/fjgc3、宿主细胞突变

宿主细胞的突变也会造成生产能力的减少。这些突变通常改变细胞调节，结果减少目标蛋白的合成。例如，控制外源蛋白表达的启动子，利用宿主细胞的启动子，如果宿主细胞启动子的改变，将大大改变质粒编码蛋白的生产水平。乳糖操纵子是常用是操纵子，通过加入乳糖或它的结构类似物（如IPTG）来启动表达，如果乳糖操纵子编码半乳糖苷透酶的基因发生突变就会阻止乳糖或乳糖的结构类似物进入细胞，从而不能启动细胞的表达。典型培养过程基因工程菌培养http:///jpkc/fjgc4、生长速率占优势的不稳定性所有这三种因素的关键是改变了的宿主载体系统和原宿主-载体系统的生长速率不同。如果改变了的宿主载体系统比原来的宿主-载体系统有生长优势，那么改变了的系统将最终占优势，基因不稳定性就出现。表达的诱导基因工程菌的产物表达需要诱导，诱因主要有：温度诱导、乳糖或乳糖结构类似物诱导、氧饥饿诱导、葡萄糖饥饿诱导、甲醇诱导等。典型培养过程基因工程菌培养http:///jpkc/fjgc五、重组大肠杆菌的高密度培养策略关键点：高密度、高表达菌密度的测定：光密度（OD值或A值）在波长600～660菌生长的障碍是重组菌携带外源基因，加重代谢负担，生长缓慢重组蛋白不能分泌到胞外，外源蛋白在菌体内合成后就会造成积累。高表达的外源蛋白尤其是高度疏水性蛋白对菌体有害，对细胞生长有抑制作用，甚至会导致细胞中毒或死亡,因此工程菌的比生长速率往往远小于宿主菌。典型培养过程基因工程菌培养http:///jpkc/fjgc高表达的障碍是：外源基因的不稳定，造成表达的下降。高生长速率与高表达之间的矛盾乙酸的产生蛋白的降解典型培养过程基因工程菌培养http:///jpkc/fjgc高密度培养的措施分批补料培养以分批培养为基础，吸取了连续培养的优点，可消除高浓度底物对细胞生长的抑制作用，还可弥补低浓度底物限制细胞生长的缺陷，从而有效地控制了菌体的生长过程。因此，要实现重组大肠杆菌的高密度培养，最常用和最有效的方法就是分批补料流加培养法。现在常用的是反馈补料培养。有几种反馈控制控制基质浓度流加恒pH流加恒溶氧流加控制比生长速率的葡萄糖流加典型培养过程基因工程菌培养http:///jpkc/fjgc典型培养过程基因工程菌培养http:///jpkc/fjgc1、控制基质浓度流加用专门的电极维持基质浓度（如葡萄糖、乙酸、氨等）。以葡萄糖为例，用葡萄糖电极检测发酵液中的葡萄糖含量，葡萄糖电极通过反馈系统与补糖单元相连。当葡萄糖浓度在设定值之上，糖阀关闭；当葡萄糖浓度由于菌体消耗低于设定值时，糖阀开启，葡萄糖以一定速率加入。这样，发酵液中的葡萄糖浓度始终保持恒定，可避免葡萄糖的抑制效应，达到很高的细胞浓度。典型培养过程基因工程菌培养http:///jpkc/fjgc2、恒pH流加大肠杆菌在LB培养基上生长，pH会上升。这是由于菌体分解LB培养基中的胰蛋白胨，造成氨积累的原因。因此用葡萄糖代替酸液进行恒pH流加。实验通过pH反馈控制系统流加葡萄糖，使pH恒定，结果推迟了比生长速率的降低时间，细胞密度是无流加的2倍。可以以葡萄糖代替酸液，以氨水代替氢氧化钠碱液，同时流加氨水和葡萄糖。这种方法的缺点是葡萄糖浓度往往不易控制，容易产生乙酸，对某些工程菌不适宜。典型培养过程基因工程菌培养http:///jpkc/fjgc3、恒溶氧流加用复膜氧电极来控制补糖。当培养液的氧饱和百分数高于控制点，糖阀开启，以一定速率补糖。加入的糖被菌利用则需要更多的氧，从而减少氧饱和百分数，引起读数下降。当读数下降到控制点以下，糖阀关闭，需氧就会随之减少，氧的饱和百分数逐渐上升，从而达到供需平衡。Konstantinov等进一步发展了这种方法，用DO-state法间歇流加葡萄糖，通过控制溶氧、搅拌转速及糖流加速率，使乙酸维持在低浓度，从而获得高密度和高表达典型培养过程基因工程菌培养http:///jpkc/fjgc4、控制比生长速率的葡萄糖流加菌体的比生长速率与代谢产物的表达密切相关。比生长速率太大，超过某一值，易产生乙酸，这一比生长速率值称为菌体的乙酸产生临界比生长速率。通过考察得出最优比生长速率，控制溶氧、转速、补糖来控制比生长速率。典型培养过程基因工程菌培养http:///jpkc/fjgc六、生长与表达的影响因素不同发酵条件下工程菌发酵结果

通气量搅拌转速DOpHOD600

诱导时间菌体湿重蛋白量111501.87.00.741.913.8%22250742.0816.7%33500462.1018.2%435004.07.00.8362.2726.4%535003.67.02.4465.1858.9%*鲤鱼生长激素基因工程菌典型培养过程基因工程菌培养http:///jpkc/fjgc1、溶氧浓度对工程菌发酵的影响在鲤鱼生长激素基因工程菌的发酵研究中发现当发酵液的溶氧为1.8~2.6ppm/L时，菌体湿重为1.9~2.08g/L外源基因表达量为13.8%~16.7%，而当溶氧值提高到4.0ppm/L时菌体湿重为2.27g/L外源基因表达量为26.4%。在诱导表达期间，要维持外源基因的高水平转录和翻译，细胞需要大量的能量代谢以促进呼吸作用。因此通过增大通气量和提高搅拌转速以保证较大的溶氧值，不仅提高工程菌的生长而且有利于外源蛋白产物的形成。典型培养过程基因工程菌培养http:///jpkc/fjgc2、pH值对工程菌生长和表达的影响在相同通气量和搅拌速度下，pH值对不同菌群生长影响不大，而对外源蛋白表达有一定影响。由于工程菌培养采用两阶段培养工艺，前期为菌体生长阶段，后期为蛋白诱导表达阶段。偏碱性的pH对外源蛋白的表达不利，因此，表达开始要调节pH在6.8-7.0之间，以保证外源蛋白的高水平表达。典型培养过程基因工程菌培养http:///jpkc/fjgc3、诱导时间对外源蛋白表达的影响诱导时间：加入诱导剂后的培养时间随着诱导时间的延长，外源蛋白的表达量增加，但外源蛋白在细胞内的积累，对重组菌产生毒性，合成速率下降，甚至产物被分解。诱导时间对酶表达水平和活力的影响诱导时间酶活力酶表达水平

00.02152.337%2118.857%3120.867%4165.068%5139.964%*L-天冬酰氨酶典型培养过程基因工程菌培养http:///jpkc/fjgc4、诱导时机对表达的影响以天冬酰氨酶表达为例，见表。在A600=0.295*10时生长速度比较快，这时菌体进入诱导状态，酶蛋白的积累加快，酶活和表达水平都较高。而菌体进入对数期后期，由于发酵液中营养的消耗，氧气的缺乏及代谢产物的积累，使菌体的生长速度明显受到抑制。在此状态下诱导，表达显然受到影响。典型培养过程基因工程菌培养http:///jpkc/fjgc诱导时机对酶表达水平和活力的影响生物量（A600）酶活力酶表达水平

0.0156.015.0%0.04919.131.1%0.16072.541.5%0.225102.649.8%0.295165.057.7%0.360105.553.4%0.41062.444.5%0.45030.222.5%*L-天冬酰氨酶典型培养过程基因工程菌培养http:///jpkc/fjgc5、乙酸对生长和表达的影响（1）乙酸的产生及抑制作用机理当葡萄糖加入量超过菌体生长和二氧化碳产生所需要量或在缺氧的条件下便会产生大量的乙酸，特别是在培养时间较长的高密度发酵过程中，问题更为严重。乙酸的产生与细胞中的电子传递链和三羧酸循环有关。Han认为细菌在低比生长速率下通过氧化代谢的作用产生的能量足以满足合成和异化的需求，不会产生乙酸，而在髙比生长速率时，大肠杆菌仅靠氧化代谢不能提供足够的能量，必须通过乙酸生成途径储备ATP和NADH。典型培养过程基因工程菌培养http:///jpkc/fjgc乙酸的生成需要两个关键性的酶，磷酸转乙酰酶（Pta）和乙酰激酶（Ack），它们催化葡萄糖代谢中从乙酰辅酶A生成乙酸的两步酶促反应。EL-Mansi和Luli假设的乙酸抑制机理是：乙酸在中性pH环境中以离子化（CH3COO－）和质子化（CH3COOH）两种形式存在，质子化的乙酸具有弱的亲脂性可以穿过细胞质膜进入胞内，在细胞内（pH7.5）解离成CH3COO-和H＋，这样就降低了膜内的pH值，使膜内外的pH差减小，减弱了质子的推动力，产生的能量就被大大减少，扰乱了细胞的正常代谢和生理活性。典型培养过程基因工程菌培养http:///jpkc/fjgc（2）减少乙酸积累的对策宿主菌不同的宿主产生乙酸不同，可通过诱变使乙酸生成途径中的两个关键酶，有一个突变了或活性降低了，使乙酸合成受阻。培养基培养基组成能影响乙酸的产生，特别是碳源的含量影响最大。在基本培养基中大肠杆菌产生的乙酸比在复合培养基中产生少。另外用甘油取代葡萄糖可以降低乙酸的生成，Han等在培养基中加入某些氨基酸（甘氨酸、甲硫氨酸）减轻了乙酸的抑制作用，提高了重组菌的生长速率和重组蛋白的产率。Klemam等研究了培养基pH值对产生乙酸的影响，发现重组大肠杆菌W3200在葡萄糖浓度为5g/L、pH6.0的培养基中乙酸生成量为6g/L.而pH7.5为12g/L。典型培养过程基因工程菌培养http:///jpkc/fjgc降低比生长速率细菌比生长速率高，乙酸的比生成速率就高，一般来说，在合成培养基中，当重组菌的生长速率超过某个临界值便产生乙酸。在连续培养中，当稀释速率超过0.2h－1才能检测到乙酸的存在。较低的比生长速率虽然产酸少，但同时对产物表达不利，因此选取合适的比生长速率才能达到高密度、高表达发酵。降低培养温度将温度从370C降低到26-300C可以降低菌体对营养物的吸收率，从而减少有机酸的形成。典型培养过程基因工程菌培养http:///jpkc/fjgc透析培养在重组菌的培养过程中可以利用透析技术除去发酵液中有害物质，降低乙酸的含量从而实现重组菌的高密度发酵。Lee等用中空纤维膜过滤装置除去乙酸，可以在较高的葡萄糖浓度下培养重组菌而得到较高的密度限制性流加葡萄糖利用葡萄糖为碳源培养重组大肠杆菌时要控制其浓度在较低的范围内，减少乙酸的生成。目前大多数高密度发酵均采取了限制性流加葡萄糖的方法利用反馈的参数，如pH，μ，OUR,CER作为控制对象，和葡萄糖流加相关联，控制流加量，使培养基中葡萄糖的浓度限定在较低水平。典型培养过程基因工程菌培养http:///jpkc/fjgc七、甲醇营养型酵母的生长和表达（一）酵母作为宿主菌的优点单细胞低等真核生物，易于培养、繁殖快、便于基因工程操作具有真核生物的蛋白质翻译后加工的功能，具有适合于真核生物基因产物正确折叠的细胞内环境和糖链加工系统分泌外源蛋白质到培养液中，利于纯化。典型培养过程基因工程菌培养http:///jpkc/fjgc酿酒酵母最先内用来作为外源基因的表达宿主菌之一，由于人们对酿酒酵母（S.Cerevisiae）的遗传学和生理学背景了解得多，及其表达的安全性。但酿酒酵母表达系统也存在一些问题：一是缺乏强有力的严格调控的启动子。目前一些常用的启动子很难精确控制或需要大量昂贵的诱导物，如半乳糖苷酶启动子需要半乳糖的诱导；二是分泌效率低，特别是对分子量大于30KD的外源蛋白几乎不分泌；三是表达菌株不够稳定，表达质粒易于丢失；四是不适于高密度培养。典型培养过程基因工程菌培养http:///jpkc/fjgc（二）甲醇营养型酵母甲醇营养型酵母主要包括Candida、Torulopsis、Hansenula、Pichia。用作表达宿主株的主要是Hansenula和Pichia。基于以上的问题，人们发展了甲醇营养型酵母作为第二代酵母表达系统。典型培养过程基因工程菌培养http:///jpkc/fjgc甲醇营养型酵母的重要特性是能利用甲醇作为唯一的碳源和能量来源。因为甲醇能诱导其表达甲醇代谢所需的酶，如醇氧化酶（AlcoholOxidase,AOX）二羟丙酮合成酶（Dihydroxy-acetonesynthase,DHAS）和过氧化氢酶（Catalase），表达的DHAS的含量甚至可达到总细胞蛋白的60-80%。而当以葡萄糖、甘油或乙醇作为碳源时，AOX几乎不表达。进一步研究表明，AOX的表达是转录水平调控的，其启动子能非常有效地控制外源基因的表达。已经在P.pastoris染色体中鉴定了二个AOX基因（AOX1和AOX2），AOX1编码的蛋白质与AOX2编码的蛋白质有97%的同源性，但AOX1基因的启动子（PAOX1）受甲醇强烈诱导，而PAOX2则很弱。H.polymorpha染色体只有一个AOX基因，也受甲醇调节。典型培养过程基因工程菌培养http:///jpkc/fjgc甲醇营养性酵母的另一个特点是甲醇代谢所需的三种酶被分拣转运入过氧化物酶体中，形成区域化。在葡萄糖为碳源时，菌体中只有一个或几个很小的过氧化物酶体，而在甲醇作碳源时，过氧化物酶体几乎占到整个细胞体积的80%，里面的蛋白质主要AOX和DHAS。典型培养过程基因工程菌培养http:///jpkc/fjgc自1987年Gregg等首次在P.pastoris菌中表达乙型肝炎表面抗原以来，短短几年间，至少有40多种外源蛋白在P.pastoris

和H.polymorpha中获得表达。表达产物分泌到培养液中或聚集在胞浆，表达量最高的可达全菌蛋白的32%或每升12g产物。H.polymorpha表达比P.pastoris有更多的优点，如更高的耐热性（理想温度为37-430C，而P.pastoris为300C）和在甲醇诱导下更快的生长速率，可减少培养时间，降低污染机会。H.polymorpha更适于大分子量蛋（150KD）的表达与分泌。典型培养过程基因工程菌培养http:///jpkc/fjgc为了提高外源表达蛋白在酵母细胞中的稳定性，免受蛋白酶的降解，通常采用以下几种方法：一是在培养液中补加一些富含氨基酸的组分如胃蛋白酶水解物或酪蛋白水解物，提高给酵母细胞蛋白酶过量的底物，以减少目的蛋白的水解；二是由于P.pastoris能耐受较宽的pH范围（pH3.0-7.0），因此可调培养液pH值抑制蛋白水解酶活性；三是改造P.pastoris表达宿主菌株，缺失基因组中主要蛋白水解酶的基因，使目的蛋白稳定。典型培养过程基因工程菌培养http:///jpkc/fjgc酵母细胞是真核生物，具有一些亚细胞结构，如过氧化物酶体等，它们对细胞的功能极端重要，过氧化物酶体内不含DNA，也无蛋白质合成机制，所有过氧化物酶体内的蛋白都由核基因编码表达，再转运入过氧化物酶体。因此蛋白质结构中必定存在一些进入过氧化物酶体所必须的局部信息。如果把表达的外源蛋白运输进入过氧化物酶体储存起来，不仅可使蛋白免受蛋白水解酶降解，增加其稳定性，还可减少外源蛋白对宿主的毒害作用。一些实验表明，甲醇营养型酵母分拣外源蛋白进入过氧化物酶体，使之区域化的信号。已鉴定出二种分拣进入过氧化物酶体所需的靶信号PTS1和PTS2。典型培养过程基因工程菌培养http:///jpkc/fjgc由于甲醇营养型酵母表达系统具有一些特殊的优点（1）应用AOX启动子，转录效率高，易于诱发调控；（2）表达质粒易于整合到基因组，不易丢失，适于高密度发酵，产量高；（3）表达产物分拣进入过氧化物酶体等因此最近十几年来，人们越来越多的应用它作为外源基因表达的系统。典型培养过程基因工程菌培养http:///jpkc/fjgc（三）甲醇营养型酵母培养中的影响因素1、甲醇浓度对基因工程菌P.Pestoris表达rHSA的影响按摇瓶培养方法每24h分别补加甲醇使其在培养基中浓度为5、10、20、30、40、50g／L诱导培养96h，结果见表2(表中数据为2个发酵瓶平均值)。典型培养过程基因工程菌培养http:///jpkc/fjgc在甲醇浓度为10g／L时毕赤酵母表达目的蛋白量达到最高，这可能是当甲醇浓度小于10g／L，甲醇成为限制性底物，限制了蛋白的表达当浓度高于20g／L时，甲酵浓度过高，对目的蛋白的表达也有抑制作用。因此，在摇瓶条件下，甲醇的最佳诱导浓度为10g／L。典型培养过程基因工程菌培养http:///jpkc/fjgc2、pH对基因工程菌P.Pastoris表达rHSA的影响按摇瓶培养方法把菌种接至用0.2mol/L的磷酸缓冲液配制好的摇瓶诱导培养基中pH分别为5.43、5.72、5.84、5.98、6.29、6.59和7.05，每24h加甲醇至终浓度10g／L进行诱导培养。典型培养过程基因工程菌培养http:///jpkc/fjgc由基因工程菌P.Pastoris表达目的蛋白和细胞光密度曲线(图1)可以看出pH为5.84时目的蛋白表达量最高。pH为5.43时，目的蛋白基本没有表达，但细胞光密度极大，说明在低pH值条件下，适合细胞生长而不适合目的的蛋白表达；当pH值在5.72—7.00时，细胞光密度基本相同，而目的蛋白表达量基本是呈逐渐下降的趋势，pH为7.05时，目的蛋白表达量明显下降。因此，既利于P.Pastoris细胞生长又利于目的蛋白高表达的pH范围为5.72—6.59。典型培养过程基因工程菌培养http:///jpkc/fjgc典型培养过程基因工程菌培养http:///jpkc/fjgc典型培养过程基因工程菌培养http:///jpkc/fjgc3、接种量对基因工程菌P.Pastoris表达rHSA的影响在用重组毕赤酵母生产人骨唾液酸蛋白的研究中发现，产物表达量与接种量有关。在BMGY中培养菌体至A600为9，离心后水洗，分别用4、2、1、1／2、1／5、1／10倍体积BMMY(1％甲醇)重悬，进行2d的诱导表达。结果表明产量随发酵密度增大而明显提高，重悬于1／5体积的BMMY中(相当于菌体吸收度A600约45)的表达量最高，为0.204g／L，但增大到A600为90时，表达量有所下降(见图2)。典型培养过程基因工程菌培养http:///jpkc/fjgc典型