第三章+微生物细胞培养技术

第三章微生物细胞培养与控制技术第一部分：培养技术少量培养大规模培养浅层培养厚层或深层液体培养固体培养液体培养静止培养通气搅拌液体培养单批培养连续培养到多级培养分散固定化细胞野生菌种突变、遗传工程菌种单菌发酵混菌发酵低密度高密度人工控制发酵罐多传感器、计算机在线控制的自动发酵微生物培养技术的发展一、表面培养实验室进行表面培养常采用试管、扁瓶和培养皿。浅盘培养表面培养法，操作简便，设备简单，常用于实验室小规模培养。但也存在一些缺点：（1）用于大规模生产的潜力很小；（2）不便于对体系进行监测控制；（3）不易于保持系统内环境条件的均一。二、深层培养厚层通风培养厌氧培养摇瓶大型发酵罐用于Hungate滚管技术中的厌氧试管剖面图厌氧手套箱fermenter生长曲线：将少量单细胞的纯培养，接种到一恒定容积的液体培养基中，在适宜条件下培养，定时取样，测菌量。以培养时间为横坐标，以细菌增长数目的对数为纵坐标，绘制所得的曲线。（一）迟缓期（lagphase）1.现象：活菌数没增加，曲线平

行于横轴。2.原因：由于细胞进入新环境,

细胞数目无增长，甚至有所下

降有一个适应过程，进行大量

的酶（诱导酶）的生成。3.细胞特点:细胞的新陈代谢非

常旺盛，个体体积显著增大，

为细胞分裂作准备。4.此期长短：与菌种遗传特性、菌龄、接种量、培

养条件有关。5.意义：在实际工作中，缩短lagphase的措施：

1）加大接种量（群体优势----适应性增强）

2）先用对数其的种子（此时细胞分裂旺盛）

3）调整培养基的成分，使种子基含有发酵培养基的成分

4）选用繁殖快的菌种（二）对数期(logphase)1.现象：细胞数目以几何级

数增加，其对数与时间

呈直线关系。2.细胞特点：此时细胞的

大小、组成、生理特征等

均趋于一致，代谢活跃，

生长速率高，代时稳定。２．代时（世代时间Ｇenerationtime,G）：单个细胞完成一次分裂所需要的时间３．意义：（１）代谢、生理研究的好材料

（２）生产中用其作种G=t/n=t1—t03.3(lgx—lgx0)（１）Ｇ与菌种有关；（２）受培养条件(温度、营养成分）的制约；同一菌种在不同培养条件下代时不同(三)稳定期（stationaryphase):2.

特点:细胞的菌体形态典型，

芽孢形成，细胞内开始

贮藏物质。1.现象：活菌数目不增不

减，生长速率趋于0,曲

线有一下降的趋势。3.出现原因：4.意义：1）营养物质大量消耗；2）有毒代谢产物大量积累；

3）外界条件影响（pH、高细胞浓度，氧化还原电位等）1）发酵生产形成的重要时期（抗生素、氨基酸等），生产上应尽量延长此期，提高产量，措施如下：补充营养物质（补料）调pH

调整温度2）稳定期细胞数目及产物积累达到最高。3）产量常数：概念：表示微生物对基质利用效率的高低

Y=菌体干重/消耗营养物质的浓度

根据产量常数可确定微生物对营养物质的需要量如：Y=0.5，表示要得到5g菌体，需某营养物（葡萄糖）10g。（四）衰亡期1.现象：细胞死亡速率>生长

速率。一般总菌数不变,活菌

数曲线下降。2.特点：菌体变形，大小

不一，细胞出现自溶,生理代

谢活动停滞。三、连续培养恒浊法恒化法（一）恒浊培养概念：在恒浊器内，调节培养基流速，使细菌培养液浊度保持恒定的连续培养方法。原理：维持菌浓度不变。特点：基质过量，菌以最高速率生长；但工艺复杂，烦琐。（二）恒化培养概念：以恒定流速使营养物质浓度恒定而保持细菌生长速率恒定的方法。原理：恒化器中动态平衡的稳定性，是以某种生长限制因子（如碳、氮源；生长因子；无机盐等）的浓度来控制菌的生长速度。特点：维持营养成分的低浓度，控制微生物生长速率。连续培养的优点1、缩短发酵周期，提高设备的利用率；2、便于自控。降低动力消耗及劳动强度；3、产品均一；连续培养的主要问题：（1）随着操作时间的增加，染菌的机率增大。如提高培养温度、改变pH或原料等，可使杂菌不易生长。

(2)连续培养的另一个问题是在长期的培养中，菌种发生变异，引起生产能力下降。

固定化细胞连续培养

细胞固定化是通过包埋法、微胶囊法、吸附法等将细胞固定在载体的内部或表面，加入营养液及合适的培养条件，得到代谢产物。

优点：可提供高密度的细胞；减少细胞的流失，反复利用；简化细胞与代谢产物的分离工艺。

缺点：成本高；易污染；物质传递阻力大；只能用于细胞分泌型产物的发酵。四、同步生长：同步培养法：能获得处于同一生长阶段

的群体细胞的培养方法同步生长：运用同步培养技术，控制微

生物生长，使之处于同一生长

阶段并同时分裂。获得同步生长的方法：1.机械法—收集同样大小的细胞密度梯度离心：选择性滤膜法:2.调整生理条件法：

温度、光、限制因子等

例：温度开始很低，使其均处在

仅活着的状态——升高温度——

同步生长３.抑制ＤＮＡ生长法：

加入代谢抑制剂，阻遏DNA

复制——解阻遏——同步五、中间补料培养（1）有利于消除或减少因易被利用基质（如葡萄糖）引起的抑制作用的影响。（2）使培养过程中的需氧量能适应培养设备的供氧能力。（3）避免培养基中的有毒组分（如青霉素发酵中作为前体的苯乙酸）对培养的影响。（4）中间补料可为实现高密度培养创造条件。六、混合培养七、高密度培养指微生物在液体培养基中细胞群体密度超过常规培养10倍以上时的生长状态或培养技术。现代高密度培养技术主要是用于基因工程菌生产多肽类药物。选取最佳培养基成分和各成分含量补料提高溶解氧的浓度防止有害代谢产物的生成第二部分：有害微生物的控制1、灭菌灭菌采用任何强烈理化因素使物体内外部的一切微生物永远丧失生长繁殖能力的措施杀菌Bacteriocidation

菌体虽死，形体尚存溶菌Bacteriolysis

菌体被杀死以后，细胞自溶、裂解而消失2、消毒概念：采用较温和的理化因素，仅杀死物体表面或内部一部分的病原菌，而对被消毒的对象基本无害实例皮肤、水果和饮用水药剂消毒巴氏消毒法3、防腐概念：

采用某种理化因素完全抑制微生物的生长繁殖（制菌作用）防腐方法及其在食品工业中的应用低温：4摄氏度以下缺氧：抽真空、充氮或二氧化碳、除氧剂干燥：晒干、烘干或红外线干燥高渗：盐腌高酸度：泡菜发酵高醇度防腐剂：苯甲酸、对羟基甲酸甲脂等4、化疗化学治疗指具有高度选择力（对病原菌具高度选择力而对其宿主基本无毒）的化学物质来抑制宿主体内的病原微生物的生长繁殖，达到治疗宿主疾病的目的的一种措施。化学治疗剂磺胺药物、抗生素、生物药物素、中草药有效成分几种常用的理化灭菌方法干热灭菌法:火焰烧灼法、烘箱内热空气灭菌法湿热灭菌/消毒法常压法巴氏消毒法煮沸消毒法：100下煮沸几分钟，饮用水消毒间歇灭菌法加压法常规加压蒸汽灭菌法连续加压蒸汽灭菌法高温灭菌1、干热灭菌法电热烘箱，150-170摄氏度1-2小时干热灭菌机理：细胞膜破坏、蛋白质变性和原生质干燥。灼烧

接种针/环、病原菌材料、动物尸体烧毁2、湿热灭菌法100度以上的加压蒸汽进行灭菌湿热温度对微生物的作用细菌与真菌营养细胞：~60度处理5~10min酵母菌细胞和霉菌孢子：~80度细菌芽孢：~120度15min湿热灭菌条件是怎么确定的？发明人：巴斯德杀死不耐热的病原菌巴氏消毒的两种类型低温维持法LTH：65度-30min高温瞬时法HTST：72度-15sec2.1巴氏消毒法2.2间歇灭菌法分段灭菌适用于不耐热培养基的灭菌操作程序保温蒸煮：80-100度15-60min保温过夜：室温或37度如此重复三次3、利用温度杀菌的定量指标热死时间热死温度4、影响蒸汽加压灭菌效果的因素灭菌物体含菌量灭菌锅内空气排除程度灭菌对象的pH灭菌对象的体积加热与散热速度5、高温对培养基成分的有害影响及防治有害影响沉淀有机物（多肽类）、无机物（磷酸盐、碳酸盐）营养破坏Maillard

反应、毒性pH值改变培养基浓度降低防止法特殊加热灭菌法分别单独灭菌低压灭菌过滤除菌法：各种滤器缺点：无法去除病毒其他方法6、过滤除菌法：不能用加热灭菌的液体物质（如维生素、血清），一般可用细菌过滤器进行除菌。7、紫外线灭菌法：