木瓜蛋白酶提取实验PPT

木瓜蛋白酶的提取、分离纯化及生物学研究木瓜蛋白酶是一种蛋白水解酶，分子量为23406，含212个氨基酸残基的单肽链最适PH值6-7，等电点为8.75，耐热，受氧化剂抑制，还原性物质激活未成熟番木瓜乳汁中含量最多木瓜蛋白酶提取纯化的方法超滤法（实验室条件不支持，得率较低）盐析法（纯度相对较高，但大量的盐，降低了木瓜蛋白酶的活性）絮凝法（酶纯度不高，杂质含量较高。）超声波法、亲和膜色谱法、双水相萃取（实验室条件不支持、且耗时长、技术难度较高）因此根据酶的理化性质，实验室的条件、操作可行性、时间等条件综合考虑，提取本实验方案，力求最大限度利用现有资源。来达到较高活力回收、高纯度的分离纯化的目的。有机溶剂沉淀法：有机溶剂能降低溶液的电解常数，从而增加蛋白质分子上不同电荷的引力，导溶解度的降低，另外，有机溶剂与水的作用，能破坏蛋白质的水化膜，降低其溶解度

硫酸铵分级沉淀法：

高浓度的盐离子在蛋白质溶液中可与蛋白质竞争水分子，从而破坏蛋白质表面的水化膜，降低其溶解度，使之从溶液中沉淀出来。实验原理取木瓜乳汁过滤粗提（酶液1）20％硫酸铵一次纯化45％硫酸铵二次纯化（酶液4’）60％乙醇纯化（酶液9’）透析除盐（酶液9’’）60％乙醇纯化（酶液5’）20％硫酸铵一次纯化45％硫酸铵二次纯化（酶液8’)透析除盐(酶液8’’)硫酸铵+乙醇乙醇+硫酸铵粗提取木瓜乳汁5ml，加蒸馏水至100ml搅拌1小时纱布过滤

3500转/min离心15min,留上清20％硫酸铵一次纯化45％硫酸铵二次纯化取20ml上清加2ml酶保护剂，加饱和硫酸铵5.5ml使其达到饱和度的20%12.5ml,静置30min，4000转离心30min，取上清加饱和硫酸铵12.5ml使其达到饱和度的45%,静置30min，4000转离心30min,取沉淀，10ml蒸馏水稀释，60％乙醇纯化透析加入1ml眉保护剂，加18.6ml的冷无水乙醇使其浓度达到60%，调节PH为6.0，静置过夜4000转离心30min，取沉淀，加10ml蒸馏水稀释透析，将稀释液装入处理好的透析袋中，透析袋置于装蒸馏水的大烧杯中，在摇床上震摇，每半小时更换一次蒸馏水，至烧杯中蒸馏水滴加到氯化钡溶液中无白色沉淀生成，取出透析袋里的酶液，测浓度及酶活粗提取木瓜乳汁5ml，加蒸馏水至100ml搅拌1小时纱布过滤

3500转/min离心15min,留上清60％乙醇纯化取20ml上清加2ml酶保护剂，33ml冷无水乙醇使其浓度达到60%调节PH为6.0，4摄氏度静置过夜20％硫酸铵一次纯化45％硫酸铵二次纯化透析4000转离心30min，取沉淀，加10ml蒸馏水稀释加1ml酶保护剂，加饱和硫酸铵2.55ml使其达到饱和度的20%,静置30min，4000转离心30min，取上清加饱和硫酸铵5.68ml使其达到饱和度的45%,静置30min，4000转离心30min,取沉淀，10ml蒸馏水稀释透析。将稀释液装入处理好的透析袋中，透析袋置于装蒸馏水的大烧杯中，在摇床上震摇，每半小时更换一次蒸馏水，至烧杯中蒸馏水滴加到氯化钡溶液中无白色沉淀生成，取出透析袋里的酶液，测浓度及酶活实验结果酶活力单位（U）定义：每分钟水解酪蛋白生成1μｇ酪氨酸所需的酶量为1个酶活力单位（U）。

酪蛋白ml酶液ml

三氯乙酸ml

酶液ml

吸光度待测液5.0150度水预热10min5.050度水预热10min/静置10min

充分过滤，滤液以水为对照在275nm处侧吸光值A空白对照

5.0

/

5.0

1.0

A0酪氨酸标准液取酪氨酸溶液，以蒸馏水为空白，测定吸光度An

编号吸光度值稀释倍数标准曲线查得值浓度（ug/ml)测得蛋白质浓度(ug/ml)体积(ml)蛋白质（酶）含量(mg)硫酸铵+乙醇10.67650016.918455.020.00169.1粗提20.61550015.357675.027.50211.1硫酸铵一次纯化上清4'0.2925007.093545.010.0035.5硫酸铵二次纯化沉淀9'0.2285005.462730.010.0027.3乙醇沉淀编号稀释倍数待测管吸光度对照管吸光度络氨酸标准液酶活(u)蛋白质（酶）含量(mg)酶比活(u/mg)硫酸铵+乙醇110000.01.3480.3280.57968,911.9169.1410.0粗提213750.00.2700.22657,469.80211.1270.0硫酸铵一次纯化上清4’5000.00.2740.19338,471.535.51090.0硫酸铵二次纯化沉淀9’5560.00.4790.30862,850.127.32300.0乙醇沉淀9’’5560.00.4330.31470,314.027.32570.0透析硫酸铵+乙醇编号吸光度值稀释倍数标准曲线查得值浓度（ug/ml)测得蛋白质浓度(ug/ml)体积(ml)蛋白质（酶）含量(mg)乙醇+硫酸铵10.67650016.918455.020.00169.1粗提5’0.76250019.119555.010.0095.6乙醇沉淀6'0.63350018.289140.012.50114.3硫酸铵一次纯化上清8'0.1735004.062030.010.0020.3硫酸铵二次纯化沉淀编号稀释倍数待测管吸光度对照管吸光度络氨酸标准液酶活(u)蛋白质（酶）含量(mg)酶比活(u/mg)乙醇+硫酸铵1100001.3480.3280.57968911.9169.1410.0粗提5’50000.2840.20139421.495.6410.0乙醇沉淀6’69400.5330.43231643.5114.3280.0硫酸铵一次纯化上清8’73000.4370.39720,737.520.31020.0硫酸铵二次纯化沉淀8’’73000.4380.38240,954.520.32020.0透析乙醇+硫酸铵SDS电泳

样品处理每孔点样量20µl。取酶液15µl于1.5EP管，加5µl上样缓冲液，至沸水中煮沸10min，冷却后可点样。电泳开始用80V恒压电泳，当样品进入分离胶界面后改用120V继续电泳，至可见的蓝色染液条带已接近胶板底部约1-2cm处停止电泳，总用时约1.5h。脱色关闭电源取下胶，放在染色液中染色30min左右，再放入脱色液中脱色(不断换脱色液)至可以清楚的看到条带为止。跑胶结果1：酶液1（粗提）；硫酸铵+乙醇4’:酶液4’（硫酸铵沉淀）；9’:酶液9’(乙醇沉淀)；9’’:9’透析过后乙醇+硫酸铵5’:酶液5’(乙醇沉淀);8’:酶液8’(硫酸铵沉淀)；8’’:8’透析过后结论及分析基于本实验硫酸铵+乙醇相比较而言更好，提出的酶比活更高硫酸铵对酶的活性可能存在抑制酶保护剂、硫酸铵和乙醇的条件选择、离心转速、反应时间、PH等多种因素均可影响实验结果。蛋白质含量（mg）酶活（u）酶比活