细胞培养技术汇编

细胞培养技术Technologyof

CellCulture王莉细胞培养技术⑴细胞生物学基础研究：细胞结构功能,如信号转导凋亡。⑵细胞培养药物测试：药物单因素及多因素的影响作用。⑶淋巴细胞培养技术的应用：检测T、B细胞数量及功能。⑷细胞用作毒性实验及安全性实验：环境毒物等。⑸细胞工程学研究手段已基本建立：克隆技术等。⑹遗传疾病的产前检查：羊水细胞、绒毛细胞培养。⑺体外培养细胞的转化：肿瘤细胞与癌基因研究。⑻在杂交瘤技术中的应用：单克隆抗体技术与应用等。⑼细胞培养在病毒学中的应用：SARS结构与功能等。⑽细胞培养在现代生物技术中应用

：如基因分离，基因测序与表达、基因转移与重组，癌基因研究等。细胞培养技术的应用细胞培养概述细胞培养概述

细胞培养(cellculture):使离体细胞在实验室人工模拟机体内的条件下，生长发育、分裂增殖的一项重要的细胞生物学研究技术。动物和植物细胞培养(这里仅讨论动物的细胞培养)，简称细胞培养。组织培养细胞培养器官培养细胞培养是把取得的组织用机械或消化的方法，分散成单个细胞悬液，然后进行培养、增殖。细胞培养的优点1.活细胞：能长时间、直接观察、研究

活细胞的形态、结构、生命活动2.可控制：重复性。可控制-调节条件：各种因素：物理、化学、生物等因素3.研究的样本具有均一性：可选择对象：哪一种类型：上皮？间质？性质：正常？肿瘤？阶段：

4.便于观测、检测和记录：

研究观察：倒置生物显微镜、荧光显微镜、电子显微镜、流式细胞术、激光共焦显微镜、免疫组织化学、原位杂交、同位素标记；记录：摄影照片、缩时电影、电视--细胞培养的优点5.应用广

学科多：对象广：

各种动物：低等动物--高等动物--人类

一种动物：不同年龄--

不同组织--

正常或异常（肿瘤--）6.较经济

可提供大量、同时、重复性好的生物学性状相似的实验对象。

细胞培养的缺点

现在人工模拟体内环境的技术已经很高，但人工所模拟的条件与体内实际情况，仍不完全相同。当细胞被置于体外培养后，生活在缺乏动态平衡的环境中，久了，必然发生变化。与体内主要不同：①相对孤立、相对单一；②缺乏体内的系统作用、失去神经体液的调节和细胞相互间的影响。主要表现：失去原有组织结构和细胞形态；分化减弱或不显；

细胞趋向单一化。

要正确认识体外培养细胞；是一种特定条件下生长的细胞群体。一、细胞培养基本原理与技术

(一)细胞在体外生长的条件体外培养的细胞需要合适的环境和必需的条件才能生存和繁殖。

1.细胞的营养需要血浆或血纤维蛋白原凝块中（早期），或在组织提取液等中生长。现知需要一些基本营养物质及生长因子等物质。

⑴基本营养物质包括：氨基酸(12种必需AA)、维生素、碳水化合物及一些无机离子。

⑵促生长因子等物质除基本营养物质外，培养细胞还需要促细胞生长因子等物质(如EGF,,IGF,IL等)才能正常生长、增殖。血清中含多种，但也有些组成不明，对细胞有害的成分。2.细胞的生存环境细胞生存并繁殖的生理学能接受限度内的物理化学特性，包括温度、气相及pH等。⑴温度：人及哺乳动物体外培养细胞的理想温度是35℃～37℃。高温比低温对细胞的影响更为明显。当温度为25℃～35℃，细胞生长很慢；4℃下能存活数天(不低于0℃)，－196℃(保护剂)。41℃～42℃下1h损伤严重，43℃以上则多数细胞将死亡。⑵气相及pH：5％CO2+95%空气，大多数细胞适于在pH7.2～7.4下生长。⑶渗透压：260～320mmol/L的渗透压适于大多数细胞。培养细胞生长的条件

3.无污染及无毒

无毒是培养细胞的必需条件。包括与细胞直接接触者和间接接触者（器皿和材料）。

污染包括细菌等微生物（细菌、霉菌、支原体）的污染。即使使用抗菌素仍是细胞培养中要非常注意的问题。污染的另一问题是不同细胞类型的交叉污染。对不同细胞系操作时，应避免使用同一瓶培养液。

培养细胞生长的条件

合适的环境和必需的条件1营养需要2环境要求3无毒及无污染培养细胞生长的条件(二)培养细胞常用设备和用品无菌室孵育室洗涤消毒灭菌室观察室准备室贮藏室细胞培养实验室操作间缓冲间更衣间

细胞培养实验室应能进行六方面的工作：无菌操作、孵育、制备、清洗、消毒灭菌处理、储藏。(二)培养细胞常用设备和用品1.常用设备和用品

⑴超净工作台：组织细胞培养技术与其他一般实验室工作的主要区别在于要求保持无菌操作，避免微生物及其他有害因素的影响。目前，超净工作台的广泛使用，很大程度上方便了组织细胞培养工作，并使一些常规实验室有可能用于进行细胞培养。

(二)培养细胞常用设备和用品

1.常用设备和用品

⑵CO2培养箱:提供进行细胞培养时所需要的一定量的CO2(浓度为5％),易于使培养液的pH保持稳定，适用于开放或半开放培养。由于这种培养方法培养器皿内部与外界相通,培养箱内空气必须保持清洁,应定期以紫外线照射或酒精消毒。同时培养箱应放置盛有无菌蒸馏水的水槽,防止培养液蒸发,使箱内相对湿度始终保持为100％。(二)培养细胞常用设备和用品

1.常用设备和用品⑶倒置显微镜⑷冰箱⑸离心机⑹电热干燥箱⑺水纯化装置(二)培养细胞常用设备和用品1.常用设备和用品⑻高压蒸汽消毒装置⑼过滤除菌装置⑽细胞冷冻装置其他移动式臭氧空气消毒机仪器

细胞冷冻储存器：常用液氮容器。新型的细胞冷冻储存器可通过先进的电子控制器实现冻存自动化并监测液氮水平和样品温度；可配备先进的报警系统，分别警报液氮液面、温度、电池、电压、电源等失常情况：同时具备热气体旁路系统，防止高于-130℃的暖空气进入液氮罐，从而更有效地保护样品，防止升温。(二)培养细胞常用设备和用品2.培养器皿

⑴培养瓶⑵培养皿⑶多孔培养板⑷离心管⑸移液管和吸管⑹其他玻璃器皿冻存管

1.2ml2ml，5ml离心管

5ml，10ml，15ml50ml细胞刮(二)培养细胞常用设备和用品3.解剖器械

4.微量移液器

(三)培养用品的清洗清洗和消毒灭菌的主要目的是去除器皿上杂质及其对细胞生长有影响的物质及各种微生物。

1.玻璃器皿：供细胞生长的玻璃表面不但要清洁干净，而且要带适当电荷。一般玻璃器皿的清洗分为4步。

(1)浸泡：新的玻璃器皿表面呈碱性，并带有如铅等，使用前必须彻底清洗。先用自来水初步刷洗，5％HCl中浸泡过夜，以中和其碱性。使用后的玻璃器皿应立即浸入清水中，避免器皿内蛋白质干涸后黏附于玻璃上难以清洗。

(2)刷洗：去除器皿内外表面的杂质。有两点需注意：一是防止损坏器皿表面光洁度，应选择软毛毛刷和优质洗涤剂,不宜用力过猛；二是不留死角,要特别注意瓶角等部位。刷洗后要将洗涤剂彻底冲洗干净,晾干。

(3)清洁液浸泡：清洁液由浓硫酸、重铬酸钾及蒸馏水配成。具有很强的氧化作用和去污能力,对玻璃器皿无腐蚀。经清洁液浸泡后,残留的未刷洗掉的微量杂质可被完全清除。

清洁液可配制成三种不同的强度,其成分用量见下表。弱液

次强液

强液重铬酸钾（g）100120

63浓硫酸（ml）

100200

1000蒸馏水（ml）

1000

1000

200

细胞培养物品清洗所需配制的清洁液常为次强液。新配制的呈棕红色，经多次使用、水分增多或遇有机溶剂时为绿色，已失效，应重新配制。

10%～30%的硝酸溶液也常用作清洁液。(三)培养用品的清洗(三)

培养用品的清洗

2.橡胶用品：组织培养液中使用的胶塞、培养瓶盖子、针头等均不能以清洁液浸泡。清洗过程中，新的胶塞因带有滑石粉，应先用自来水冲洗干净，再进行常规清洗；使用后的胶塞、盖子应及时浸泡在清水中。然后用洗涤剂刷洗。

3.塑料器皿：包括各种培养板、培养皿及培养瓶等。这些产品主要为进口的一次性物品，供应商提供给用户时已消毒灭菌并密封包装，打开包装即可使用。由于各种原因，部分实验室尚未能做到将这类物品完全作一次性使用，仍需经过清洗和消毒灭菌后反复使用。清洗方法通常是：用后立即以流水冲洗干净或浸入水中，防止干涸。超声波清洗机内加入少量洗涤剂清洗30min，流水彻底冲洗干净，清洁液浸泡过夜，流水彻底将残留清洁液冲洗干净，蒸馏水漂洗2～3次，三蒸水漂洗2次，晾干备用。亦可采用下述步骤：器皿经冲洗干净后，晾干，2％NaOH浸泡过夜，自来水冲洗，5％盐酸浸泡30min，流水彻底冲洗，蒸馏水漂洗。但不宜反复使用次数太多。

（三）

培养用品的清洗

4.包装:组织培养的器皿需清洗、晾干。在消毒前必须进行包装，以便消毒及储存，防止落入灰尘及消毒后再次被污染。一般用皱纹包装纸、硫酸纸、牛皮纸、棉布等作为包装材料，对培养瓶、滤器、存放培养液用贮液瓶、吸管和胶塞（或培养瓶盖子）等物品的容器瓶口部分做局部包装密封，再用牛皮纸、玻璃纸或布包起来备用。对体积小的培养皿、移液器吸头等可以全封闭包装。注射器、金属器械可直接装入铝制饭盒或不锈钢等容器内。重复使用的培养板则用优质塑料纸严密封口。

（四）培养用品的灭菌与消毒根据材料的要求可采用不同的消毒灭菌方法。总的说来有物理方法及化学方法两大类。物理方法包括用湿热(高压蒸汽)、干热、紫外线、射线、过滤、离心沉淀等方法杀灭或去除微生物；化学方法是使用化学消毒剂、抗菌素等杀灭微生物。以下重点介绍组织细胞培养常规工作常用的几种消毒方法：

1.干热消毒：一般在烤箱中进行，主要用于消毒玻璃器皿。干热消毒后的器皿干燥，易保存。缺点是干热传导慢，可能有冷空气存留于烤箱内，因此要用较高的温度和较长的时间才能达到消毒的目的，需加温到160℃，保持90～120min方能杀死芽孢。消毒完毕后不可马上将烤箱门打开，以免冷空气突然进入，影响消毒效果和损坏玻璃器皿或发生意外事故。

2.湿热消毒：湿热消毒是一种有效的消毒方法,一般使用高压蒸汽灭菌器进行消毒。为了保证消毒的效果，消毒物品不应装得太满，以便消毒器内气体流通；导气管要伸至罐底并防止堵塞，在加热升压之前，打开排气阀门，使加热后消毒器内的残留冷空气排出。冷空气排出后，关闭排气阀门，开始升压，待达到所需要的压力时，开始记录时间，并控制压力恒定。高压消毒可在5、10、15、20磅的压力下进行，持续时间可为10、15、20、30min。

根据不同的物品选择不同压力和时间，一般物品(如布类、金属器械、玻璃器皿等)消毒的要求是15磅20min，一些常规使用的液体的消毒要求为15磅15min，橡胶用品为10磅10min。一般认为在这种情况下于1min内几乎可杀死所有微生物，但由于在消毒物品的包装内可能仍有冷空气未全部排出或蒸汽尚未能达到消毒器内的各部分，所以要延长消毒时间。消毒完毕后一定要先打开阀门放气，再打开消毒器的盖，以免发生意外。

（四）培养用品的灭菌与消毒脉动真空灭菌器

消毒灭菌的方法

3.紫外线消毒：紫外线直接照射消毒是目前各实验室常用的方法之一，主要用于实验室房间里的空气、操作台表面及桌椅等消毒。但在房间内安装不能高于2.5m。要使各处达到0.06μw/cm2的能量照射，否则影响消毒效果。也可以用紫外线消毒一些塑料培养器皿（如塑料培养皿、塑料培养板等）。缺点是消毒有死角。现已有电子灭菌灯可以代替紫外线灯进行实验室的空气消毒。

消毒灭菌的方法

4.过滤除菌消毒：血清、合成培养液、酶及含有蛋白质具有生物活性的液体等不能用高压消毒的方法进行灭菌，可采用过滤方法除菌。滤器有抽吸(抽滤)式及加压式两种类型；滤板(或滤膜)结构可为石棉板、玻璃或微孔膜。

(1)

玻璃滤器：以烧结玻璃为滤板固定于玻璃漏斗上。一般都使用G6型。其缺点是速度较慢。

(2)微孔滤膜滤器：为金属结构，但其中间为一种一次性的特制混合纤维素脂滤膜。可用于包括血清在内的各种培养液的过滤除菌，速度较快，效果较好。微孔滤膜滤器可为加压式(正压式)或抽滤式,由于加压式微孔滤膜滤器过滤效果好、使用方便、易清洗，目前使用最为广泛。消毒灭菌的方法针头式滤器消毒灭菌的方法

5.消毒剂及抗菌素：组织细胞培养工作中也可利用消毒剂来进行灭菌处理，消毒剂主要是75％酒精、过氧乙酸、乳酸等化学制剂。可分别用于操作人员的皮肤、实验台、器械、器皿的操作表面，实验室的桌、椅、墙壁、地面及空气等的处理。如75％酒精最为常用，用途也最广泛；0.1％新洁尔灭可对器械、皮肤、操作表面进行擦拭和浸泡消毒；乳酸可用于空气消毒；另外尚有各种用于地面消毒的消毒液（例如三花消毒液、过氧乙酸等）可供选用。

抗菌素也常在组织细胞培养中使用，但多数是为了预防。要注意的是不能完全依赖抗菌素来达到消毒灭菌。常用的抗菌素为青霉素和链霉素。

消毒灭菌的方法

6.其他方法：

(1)

电子消毒器消毒灭菌：使用市售的电子灭菌器可消毒不宜高热灭菌的器皿及用物，例如塑料制品等，消毒时间通常为30min，消毒完毕应及时关闭消毒物品容器。

(2)

辐射灭菌：通常采用放射性60Co照射需灭菌的各种不宜高热灭菌的器皿及用具以及部分实验用药物、制剂等。。

(五)无菌操作的基本要领和要求

细胞培养工作中的消毒灭菌方法如上面所述可有多种，应根据具体情况选择应用适当的方法。

实验室环境的消毒：实验室中空气的消毒，最理想是采用过滤系统与恒温设备结合使用，但价格较昂贵。亦可用紫外线消毒。另外尚可用乳酸等蒸汽或电子灭菌灯消毒。实验室的地面多用新洁尔灭溶液等处理。桌椅等亦多用消毒剂消毒处理，最常用的是以酒精擦拭，亦可用紫外线照射。

超净工作台的消毒洗手和着装火焰消毒无菌培养操作

组织细胞培养时除必须有培养基（液）外，还需要水和大量不同的溶液，包括盐溶液、消化液、缓冲液、抗菌素液及用于检测的各种染液等。

所需试剂及器械主要包括：干粉型培养基、胰蛋白酶，青霉素、链霉素、纯净水系统、电子天平、pH计、磁力搅拌器、滤器、微孔滤膜、O2、烧杯、量桶、贮液瓶、瓶塞、注射器、三蒸水、胎(小)牛血清、NaOH、HCl、高压灭菌器等。

平衡盐溶液(六)细胞培养用液(六)细胞培养用液

1.平衡盐溶液

平衡盐溶液(balancedsaltsolution，BSS)具有维持渗透压，调控酸、碱平衡的作用，并可供细胞生存所需的能量和无机离子成分，另外尚可用作洗涤组织、细胞以及配制各种培养用液的基础溶液。平衡盐溶液(BSS)主要是由无机盐和葡萄糖组成，其中无机离子是细胞生命的必要成分；在维持渗透压、缓冲和调节溶液pH方面也起着重要作用。Ca2+、Mg2+能为酶系统的活化提供条件，也是细胞膜的重要组成成分。葡萄糖等可为细胞代谢提供能量。水体外培养细胞对水的质量非常敏感，要求很高。水的纯度不够,即使有害元素含量极少对，细胞也会产生不利的影响，有时引起细胞中毒死亡。因此配制所有的培养液和各种溶液应使用纯化水。组织培养必须使用玻璃蒸馏器制备的三次蒸馏水。二次蒸馏水或一次蒸馏水可用以清洗器皿或配制一般洗液。平衡盐溶液

平衡盐溶液(BSS)主要是由无机盐和葡萄糖组成，其中无机离子是细胞生命的必要成分；在维持渗透压、缓冲和调节溶液pH方面也起着重要作用。Ca2+、Mg2+能为酶系统的活化提供条件，也是细胞膜的重要组成成分。葡萄糖等可为细胞代谢提供能量。

目前最常用的BSS是Hanks液、Eagle液和PBS等。在细胞培养中，BSS用途如下：①作为配制培养基的基础溶液。②配制各种试液：如配“胰酶”消化液。③用于洗涤组织和细胞。平衡盐溶液PBSEarleHanksDulbeccoD-HanksNaCl8.006.808.008.008.00KCl0.200.400.400.200.40Ca(Cl)20.200.140.10Mg(Cl)2·6H2O0.10MgSO4·7H2O0.200.20Na2HPO4·2H2O1.560.061.420.06NaH2PO4·H2O0.14KH2PO40.200.060.200.06NaHCO32.200.350.35Glucose(葡萄糖)1.001.00Phenolred(酚红)0.020.020.020.02

为了便于保存和减少有关成分的化学反应，此液可配成20×、10×和5×浓缩液的储存液(母液)。

10×母液配制法

甲液：取450ml三蒸水依次溶解下列试剂

NaC180.0gKCl4.0gMgSO47H2O2.0gCaC121.4g(2H2O1.85g)

待完全溶解后，补足三蒸水至500ml。

乙液：取450ml三蒸水依次溶解下列试剂

Na2HPO40.6g(12H2O1.52g)KH2PO40.6g

葡萄糖10.0g0.4％酚红50.0ml平衡盐溶液

消化液（细胞分离液）常用的细胞分离液有胰蛋白酶和二乙胺四乙酸二钠(EDTA)和胶原酶等，它们在制备原代细胞时可消化组织、分散细胞，在传代细胞时使细胞脱离生长表面(瓶壁)和使细胞团离散成单个细胞。它们可单独使用，也可按一定比例混合使用，这主要取决于所培养细胞的要求。消化液胰蛋白酶

⑴胰蛋白酶:主要来自牛或猪的胰脏，淡黄色粉末，易潮解，应放置冷暗干燥处保存。主要作用是使细胞间的蛋白质水解，使细胞离散。其活性是用水解酪蛋白的能力表示，常使用1：125和1：250，即1份胰酶分别能解离125份和250份酪蛋白,胰酶的离散作用与细胞的种类和特性密切相关。不同细胞系对胰酶溶液的作用浓度、温度和时间等的要求也不一样。浓度大、温度高、作用时间长对细胞的分离能力也越大，但超过一定限度也会损伤细胞、胰酶在pH8.0，温度37℃时，作用力最强。Ca2+、Mg2+

、血清、蛋白质的存在会降低其活力，可用无Ca2+、Mg2+的溶液配制，需要终止消化作用时，可加入一些血清或含血清的培养液或胰酶抑制剂来终止胰酶对细胞的继续作用。

（2）乙二胺四乙酸钠（EDTA）

EDTA是一种化学螫合剂，对细胞有一定的解离作用，且毒性小，常用浓度为0.02%。将胰蛋白酶和EDTA联合使用，会提高分散细胞的效力。

0.02%EDTA溶液(亦称为Versen液)：称取适量EDTA，用D-Hanks溶液溶解，10磅15min高压灭菌，分装小瓶，4℃冰箱保存。用于分散消化细胞。

（3）胶原酶

胶原酶的常用剂量为200U/Ml(约为1mg/ml）。培养用液-消化液

常用培养基（液）培养基可分为天然培养基和合成培养基。天然培养基，主要来自动物体液或从组织分离提取制备的，其营养成分较高，但成分复杂，个体差异较大，来源也有一定的限制。

合成培养基是根据天然培养基的成分，用化学物质模拟合成的，具有一定的组成，是较理想的培养基。但对动物细胞来说，它只能维持细胞的生存，要想使细胞生长和繁殖，还需补充天然培养基，即两者混合在一起使用,效果更好。合成培养基的出现,促进了组织培养的发展，避免了生物差异的影响,细胞生长健康透明,延长了体外存活的时间，价廉易制取。培养基（液）

天然培养基天然培养基（naturalmedia）包括：血清、组织提取液等。血清是细胞培养中最常使用的天然培养基。血清中含有许多能维持细胞生长增殖不可缺少的成分，如蛋白质、多肽、激素及各种氨基酸、葡萄糖、酮酸等营养成分。

⑴血清：分人血清和动物血清两大类。细胞培养中最常用的是动物血清，来自牛、马、兔等动物，其中牛血清比马血清用得更广泛。牛血清分为胎牛血清（fetalbovineserum，FBS）和小牛血清（calfserum，CS）两种。培养基－天然培养基

FBS是经剖腹从母牛子宫中取出的胎牛中分离到的血清，价格贵；CS是从刚出生但尚未哺乳的小牛中分离到的血清。

购置的血清应做热灭活处理。将小牛血清置于56℃水浴中灭活30分钟，以破坏补体及一些污染微生物(如病毒、支原体等)，放置4℃冰箱中，无菌试验阴性。未灭活的血清不稳定，应保存于-20℃冰箱中。

FBS(fetalbovineserum)和FCS(fetalcalfserum)是相同的意思，两者都是指胎牛血清，FCS乃错误的使用字眼，请不要再使用。

CS(calfserum)

则是指小牛血清HS(horseserum)则是指马血清

天然培养基

许多早期的组织培养基主要成分是由动物产品或组织抽提物。1950年。Morgan和他的同事曾报道了他们努力生产一种完全限定营养来源的细胞培养基（69种成分的199配方，开始了人工合成培养基的历史）。

合成培养基（Syntheticmedia）是根据研究和了解细胞所需成分的基础上配制而成的，现已成为普遍应用的商品化的培养基。但合成培养基尚未成为十分完全的培养基，它只能维持细胞不死，而不能促进细胞增殖生长，使用时尚需添加天然培养基，主要是牛血清。目前常用的合成培养基主要是MEM、Eagle、RPMl-l640、199培养液等。合成培养基（液）

合成培养基(液)基本成分合成培养基的种类虽多,但一般均含有氨基酸、维生素、糖类、无机离子和一些其他的辅助成分。

随着科学技术的进步和细胞培养技术的发展，人工合成培养基不仅品种增加，配方相对固定，并形成配制好的干粉型商品，而且培养基成分趋于简单化。现今市售的Eagle、RPMI1640和DMEM等培养液比以前已有了较大改进，增减了一些成分，以满足细胞培养中新技术的需要。如杂交瘤技术中常用的DMEM培养基，使用时需补加丙酮酸钠和2-硫基乙醇（2-mercaptoethanol,2-Me），以促进分裂原的反应和DNA合成，增加细胞转化。2-Me常配制成0.1mol/L的贮存液，用时每升培养液加0.5mL。PHA有市售的商品。合成培养基（液）

人工合成培养基的优点

①人工培养基是用已知成分配制，培养条件一致。②它可以精密地测定培养的细胞与培养液内物质变化的情况，用生化定量的方法可以分析各种组织以及各种实验条件下不同组织细胞的生长和代谢，这也可提供和筛选更加有利于细胞生长的更趋简化的培养基。③用人工培养液培养的细胞比较透明清楚，胞浆内的颗粒很少，换液时间可适当延长，从而节省人力、物力。④人工合成培养基克服了天然培养基中可能潜在病毒污染的缺点，有利于培养和研究病毒。⑤培养基成分便于储存和大量配制，便于细胞大量生产。合成培养基（液）

合成培养基种类已有几十种。

⑴199培养液

是第一个合成培养基于1950年问世，它含69种成分(见教材P43-45)，几乎包括了所有的氨基酸、维生素和一些核酸衍生物、生长激素、脂类，加上硝酸铁和生理盐溶液，此较为复杂的合成培养液仅能短时间维持各类细胞的生长，只有加了血清之后才能作为生长培养基。199成分复杂，最近已不大使用。常用合成培养基（液）

⑵Eagle培养基(DMEM)

常用的是MEM(MinimumEagleMedium，低限量培养基)，仅含12种必需氨基酸、谷氨酸胺和8种维生素，成分简单，适合各种已建成细胞系的培养，同时宜于添加或减少某些成分，也特别适于特殊研究的细胞培养工作。在它的基础上改良的DMEM(Dulbecco’smodifiedEaglemedium，Dulbecco改良的Eagle培养基）应用也十分广泛。

DMEM增加了各成分的用量(双倍)，葡萄糖用量可选择低糖(1000mg/L)或高糖(4500mg/L)，对于生长速度较快，附着性较差的肿瘤细胞生长有利。特别应用在附着性较差，但又不希望它脱离原来生长点的克隆培养时，采用高糖的培养液效果较好。常用于杂交瘤技术中骨髓瘤细胞和DNA转染的转化细胞的培养。常用合成培养基（液）

⑶RPMl-l640

是一种常用的培养液，最初是针对淋巴细胞的培养而设计的，问世后发现能广泛适应许多种类的细胞，包括正常细胞和肿瘤细胞的培养，而且成分简单，和MEM一样应用十分广泛。

⑷F12培养基

F12培养基成分复杂，含多种微量元素，最初设计用于克隆二倍体的中国地鼠卵巢细胞。起初是作为一种无血清配方设计的，现常补加血清用于支持各种正常的和转化细胞的增殖。F12常和DMEM以1：1结合，称为DME/F12培养基(DME/F12medium)，作为开发无血清配方的基础，以利用F12含有较丰富的成分和DMEM含有较高浓度的营养成分的优点。常用合成培养基（液）常用合成培养基（液）

人工合成培养基是细胞培养基的基础培养液，称为基础培养基，因它提供细胞生存所需的营养成分，还称为细胞营养液。人工合成培养基有干粉型、1倍工作液型和10倍浓缩型。常用的干粉型培养基性质稳定，便于储存和运输，使用方便。使用时按照说明书要求配制，要确保营养液所有组分完全溶解，并在消毒和保存过程中不产生沉淀。下面以RPMI-1640培养液为例，简介配制方法。合成培养基(液)的配制

RPMI-1640基础培养液

甲液：RPMI-164010.4g,Hepes2.7～5.4g,三蒸水700ml,磁力搅拌至颗粒完全溶解(3～4h，橙黄色)。

乙液：NaHCO32.0～2.2g,三蒸水30ml。37℃，30min颗粒溶解。将甲、乙两液混合，加水至终体积1000ml，在4℃静止2～3h。滤过除菌，分装，抽样做无菌试验，－20℃冻存。

RPMI-1640血清细胞培养液

RPMI-1640基础营养液80ml灭活小牛血清20ml青霉素、链霉素各100U/ml,pH7.1～7.2。合成培养基(液)的配制

血清细胞培养基人工合成培养基只能维持细胞生存，要想使细胞生长和繁殖，还需补充一定量的天然培养基，常用的是血清、谷氨酰胺等。另外，为防止污染，培养液中还要添加一定量的抗菌素。

基础培养基加血清、谷氨酰胺、抗菌素等物质后，叫细胞培养基，也叫完全培养基。细胞培养基按血清含量多少又分为两种，即细胞生长培养基和细胞维持培养基。

合成培养基(液)的配制

细胞用液的分装要求①行严格无菌操作。尽量减少试剂在空气中的暴露时间。②根据配量准备分装瓶和瓶塞，分装瓶规格、数量应根据实验需要准备。避免因包装瓶过大、贮液时间过长或反复冻融使用造成营养成分丢失和微生物污染。按一次用量或一周内用量挑选小包装瓶。融化后的液体置4℃保存。③分装前做好分装量标记，分装瓶内液体量要小于瓶容积的2/3。④做好分装瓶标记，包括试剂名称、浓度、配制日期、组号。合成培养基(液)的配制

生长液与维持液:血清含有多种促进细胞生长、贴附的活性物质。合成培养基中不加血清或低浓度(如2％）血清，仅能维持细胞生存，细胞不能很好生长，这种培养基称为维持液。加入5％的血清，对大多数细胞来说，能维持不死和缓慢生长。一般需加入10％－20％血清，有利于细胞生长，称为生长液。添加血清，虽利于细胞生长，但不明成分也增多了，对分析实验结果增加了困难。人们正在探索不用血清的无血清培养基。合成培养基(液)的配制

无血清细胞培养基血清中究竟哪些成分是细胞生长所必需的呢?几十年来没有明确答案。还有一些细胞在血清培养基中不能生长。另外，由于血清成分复杂，常常给细胞培养后的研究工作，如细胞产物的提取、激素和药物作用机理的研究带来困难。

1975年，Sato成功地用无血清培养基培养了垂体细胞株CH4，还有人用HamF12无血清细胞培养基成功地克隆了CHO细胞。近20多年来已报道了几十种细胞系(株)在无血清细胞培养基中成功地生长和增殖，这些细胞有内分泌细胞、表皮细胞、神经细胞、淋巴细胞、成纤维细胞和肾细胞等。无血清细胞培养基的使用保证了实验结果的准确性、可重复性和稳定性，减少细胞污染，简化了提纯和鉴定McAb、淋巴因子、干扰素等细胞产物的程序，降低疫苗反应。无血清培养基(液)

无血清培养基一般由基础培养基和替代血清的补充成分组成。

基础培养基:必须根据不同的培养细胞选用合适的基础培养基。常用的基础培养基有MEM、NT、M199、F12、DMEM、RPMI-1640、IMDM、DMEM：F12＝1：1、RPMI-1640：DMEM：F12=2：1：1等，其中DMEM和F12混合培养液为多种细胞使用，根据不同细胞的要求，每升中补加Hepes15mmol，NaHCO31.2—2.4克。

无血清培养基的补充成分:补充成分即代替血清的各种因子的总称。多数无血清培养液必须补加3～8种因子，任何单一因子不能取代血清，至少需两种。已知有100多种此类因子，其中有些是必需补充因子，如胰岛素、硒酸钠(Na2SeO3)和转铁蛋白，其它多数为辅助作用因子。补充成分按功能将其分成四类。无血清培养基(液)

⑴激素和生长因子:很多细胞用无血清培养时需加入激素，如胰岛素(Ins)、生长激素、胰高血糖素等。此外，甾体激素如孕酮、氢化可的松、雌二醇等也是无血清细胞培养时常用的补充因子。每种细胞至少有2～3种生长因子对其正常生存和增殖起着调节作用，因此估计机体中约有100多种生长因子。按结构和功能可分为表皮生长因子(EGF)、神经生长因子(NGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)等。生长因子是有效的促有丝分裂原，能缩短细胞倍增时间。无血清培养基(液)

⑵结合蛋白:结合蛋白有两种，一种是转铁蛋白(TF)，它能增强细胞摄取和利用培养液中铁的能力，还可结合毒性金属离子，不同细胞需要量不同。另一种是白蛋白，它与脂类、金属离子、激素等结合后，具有刺激细胞增殖作用。

⑶贴壁因子绝大多数真核细胞在体外生长时需要固着于适当的基底，帮助细胞固着贴附的物质叫贴壁因子或胞外基质。体外培养细胞常于粘着斑(adhensionplaque)或其近旁发现纤黏连蛋白(fibronectin，FN)，此处质膜下正是纽带蛋白(vinculin)及α-辅助肌动蛋白(α-actin)存在部位。肌动蛋白丝借助这两种蛋白质附着于质膜的内表面。FN又与非胶原糖蛋白相连。膜上FN受体将细胞外基质FN与细胞内肌动蛋白丝相连。这样，胞外基质、细胞膜受体及细胞内某些分子直接或间接作用，共同形成细胞结构和功能的统一体，成为控制细胞形态、功能、生长、分化以及某些其它性质(如影响质膜中蛋白质的组织等)的重要因素之一。如体外培养的神经元存活及分化主要决定于所提供的细胞外基质；肌细胞分化，肝细胞和乳腺细胞的形态、代谢，肿瘤细胞的转移过程，都与ECM有关。无血清培养基(液)

⑷微量元素微量元素对细胞长期传代的作用于1981年由Murakam首先报道。硒元素不仅具有抗过氧化物酶对细胞的毒副作用，还可促进细胞生长。1983年Clereand用一组复杂的微量元素，使8株杂交瘤细胞生长繁殖。

酶抑制剂实验证实长期使用无血清细胞培养基培养细胞，会改变细胞的某些特性。是因为在细胞传代时，常需借助酶的作用，无血清培养基缺乏对细胞保护的成分，残余的酶会对细胞造成损伤，因此无血清培养基内必须添加酶抑制剂以中止残余酶的作用。目前常用的是大豆胰酶抑制剂(soybeantrypsininhibitor)，使用浓度为0.1％－0.5％，滤过除菌后，将其加在DMEM/F12基础培养液内。目前无血清细胞培养基仍处在探索阶段，尚无固定配方。无血清培养基(液)

pH调整液:合成培养基大都呈弱酸性，而细胞生长的最适pH为7.0－7.2，可忍耐的pH范围6.6－7.8。pH到7.6时，细胞虽有代谢但不再分裂增殖，故使用培养基时要调整pH，并注意培养过程中的pH变化以及时换液。常用的pH调整液是NaHCO3、HEPES等。细胞培养用液-其他溶液NaHCO3溶液:常用的浓度有7.4％、5.6％、3.7％。

HEPES:为了较长时间恒定pH，可使用缓冲能力较强HEPES（N－2－oxyethylpiperazineN’-2-ethanesulfonicacid，N-2-羟乙基派嗪-N’-2-乙磺酸），使用的终浓度为10－50mmol/L，可以根据缓冲能力的要求而定。

抗生素液:常用的有青霉素、链霉素、卡那霉素、庆大霉素、二性霉素等。常配成100×或200×于使用浓度的盐溶液内，分装小瓶，冷冻保存。使用前加入到培养液内，每小瓶最好一次用完。细胞培养用液-其他溶液

L-Glutamin(谷氨酸)溶液制备

L-Glutamin(分子量146.15)6g

三蒸水200ml

滤过除菌；分装；－20℃保存；使用时每100ml培养液加lml。(一)原代细胞培养

原代培养（primary

culture）从动物机体取出的进行培养的细胞群。生长缓慢，繁殖一定的代数后（一般10代以内）停止生长。

细胞株（cell

strain）从原代培养细胞群中筛选出的具有特定性质或标志的细胞群，能够繁殖50代左右，在培养过程中其特征始终保持。

细胞系（cell

line）从肿瘤组织培养建立的细胞群或培养过程中发生突变或转化的细胞，在培养条件下可无限繁殖

克隆（clone）亦称无性繁殖系或无性系。对细胞来说，克隆是指由同一个祖先细胞通过有丝分裂产生的遗传性状一致的细胞群。

二、细胞培养的方法原代细胞培养方法与步骤

⑴取材⑵消化与分散组织⑶离心和计数

⑷接种培养⑸观察

单层细胞培养法（见录像）和组织块培养法。

细胞换液：全量换液和半量换液。换液时机的选择：培养液pH值：细胞生长旺盛，代谢产生酸性物质积累增多，pH值下降，营养液酸化变黄。细胞状态。二、细胞培养的方法

鼠胎组织细胞原代培养

取材：用颈椎脱位法使孕鼠迅速死亡。把整个孕鼠浸入盛有75％乙醇的烧杯中数秒钟消毒，取出后放在大平皿中携入超净台。用消过毒的剪刀在躯干中部环行剪开皮肤，剖腹取出子宫置于无菌平皿中。用消过毒的剪刀剪开子宫，取出鼠胎，剪去头、爪，以平衡盐溶液洗去血污。

切割：用平衡盐溶液将取出的组织块清洗三次，然后用眼科手术剪刀仔细将组织反复剪碎，直到成1mm3左右的小块，再用平衡盐溶液清洗，洗到组织块发白为止。静置数分钟，使组织块自然沉淀到管底，弃去上清。

消化、接种培养：加入0.25％胰蛋白酶消化液（5-10倍量），与组织块混匀。置37℃水浴，观察消化情况（每隔几分钟摇动一下试管），静止，吸去上清，加入5～10ml细胞培养液，用吸管吹打混匀，移入二个培养瓶中，置于二氧化碳培养箱中培养。

（二）细胞传代培养

⑴原代细胞传代以便获得稳定的细胞株。

⑵细胞系传代以得到大量的同种细胞，并维持细胞种的延续。⑶接触抑制。⑷营养枯竭。⑸方法：洗细胞，消化，接种，观察。将培养的细胞从培养器皿中消化下来，以1:2或l:3以上的比率转移到另外的器皿中进行培养，即为传代培养。(悬浮细胞的直接和离心传代)

细胞“一代”指从细胞接种到分离再培养的一段期间，与细胞世代或倍增不同，在一代中，细胞培增3～6次。二、细胞培养的方法

（一）培养细胞的生长特征与形态分型

1.单层培养细胞的生长过程⑴游离期：悬浮，胞质回缩，全部细胞变为圆球形。⑵吸附期：贴附底物，一般24小时内贴壁。⑶潜伏期：此时细胞有生长活动，基本无增殖。细胞株潜伏期一般为6～24小时。⑷对数生长期（增殖期）：细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合进行实验研究。⑸停止期（平台期/维持期）：细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂。机制：接触抑制、密度依赖性。⑹衰退期：细胞内颗粒进一步增多，透明度降低，立体感差。最后细胞皱缩，胞质出现空泡，从瓶壁上脱落下来。

三、体外培养细胞的观察方法

（一）培养细胞的生长特征与形态分型

2.培养细胞的形态分类按生长方式:贴壁型细胞（Monolayercells）。悬浮型细胞（Suspensioncells）。绝大多数有机体细胞属贴壁型细胞，只有少数细胞类型如某些肿瘤细胞和白细胞可在悬浮状态下生长。按细胞形态(贴壁细胞）：成纤维型细胞（Fibroblast-likedcells）。上皮型细胞（Epithelium-likedcells）。其它，不定型。

三、体外培养细胞的观察方法成纤维型细胞梭形或不规则三角形中央有卵圆形核胞质向外伸出长短不同的突起中胚层间质起源

上皮型细胞扁平不规则多角形细胞中央有圆形核紧密相连单层膜样生长内、外胚层细胞如皮肤、表皮衍生物、消化管上皮等

游走型细胞散在生长，一般不连成片细胞质经常伸出伪足或突起活跃的游走或变形运动羊水细胞培养的早期多形细胞型难以确定规律和稳定的形态如神经组织的细胞等

（二）细胞计数方法与显微测量三、体外培养细胞的观察方法

（一）细胞的冻存方法四、培养细胞的冻存、复苏与运输冷冻保存要点冷冻过程要缓慢：4℃30～60分钟→-20℃30分钟→-80℃16～18小时（或过夜）→液氮长期保存或使用程序降温盒，每秒下降1℃冻存细胞必须处在对数生长期，活力大于90％，无微生物污染。细胞浓度控制在：5×106～2×107/ml。常用细胞冷冻保存液5%或10％DMSO(二甲基亚砜，终浓度＜1%)＋完全培养液10％甘油＋完全培养液不含DMSO细胞冻存液

（二）细胞的复苏四、培养细胞的冻存、复苏与运输快速解冻冻存细胞从液氮中取出后，立即放入37℃水浴中，轻轻摇动冷冻管，使其在1分钟内全部融化（不要超过3分钟）解冻后的细胞可直接接种到含完全生长培养液的细胞培养瓶中直接进行培养，24小时后再用新鲜完全培养液替换旧培养液，以去除DMSO。如果细胞对冷冻保护剂特别敏感解冻后的细胞应先通过离心去除冷冻保护剂，然后再接种到含完全生长培养液的培养瓶中(一)生长曲线的测定五、培养细胞增殖动力学方法细胞悬液制备接种细胞技术绘制生长曲线

(二)分裂指数测定分裂指数＝分裂细胞数/细胞总数×100%

(三)克隆(集落)形成试验

(四)BrdU渗入法测定细胞增殖指数(一)细胞污染的种类六、细胞培养的污染和检测

细菌、酵母菌、霉菌和病毒

(二)污染源

无菌操作技术不当操作室环境不佳污染之血清污染之细胞

白色念珠菌污染真菌感染

支原体污染电镜照片,煎蛋状和其他形状95％以上是以下四种支原体：口腔支原体(M.orale)，精氨酸支原体(M.arginini)，猪鼻支原体(M.hyorhinis)，牛莱氏无胆甾原体(A.laidlawii)