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制作宿舍：520女明星全裸出镜代言粉红丝带2005年女明星全裸出镜代言粉红丝带2006年女明星全裸出镜代言粉红丝带2007年女明星全裸出镜代言粉红丝带2008年女明星全裸出镜代言粉红丝带2009年不容忽视的美丽女性健康第一杀手乳腺疾病性感乳房疾病的比例据统计，全球每年约50万女性患上乳腺癌，女性患上乳腺疾病的几率高达10%，特别是35—45岁的女性，更是女性的高发年龄，目前，乳腺癌已经成为严重威胁我国妇女健康的第一杀手！70%的女性在25到50岁，有乳房纤维囊肿症状。从数字看乳腺疾病乳腺癌已发展为全球发病率排第一位的恶性肿瘤，占各种恶性肿瘤的7-10%，我国乳腺癌发病率以每年3%的速度递增，全世界每年约有120万妇女患乳腺癌，50万人死于乳癌。

乳腺癌已成为中国城市女性“第一杀手”，平均每十二分钟就有一名女性死于乳腺癌，且正以每年百分之三到四的增长率急剧上升。

“林黛玉”一角的扮演者：陈晓旭终年42岁……叶凡终年37岁蔡琴汪明荃李媛媛终年41岁健康如此重要，那现在的检测手段有那些呢？（一)X线检查双侧乳腺作正侧位摄片是乳腺癌常用的诊断（二)热图像检查有液晶和远红外热图象（三)近红外线扫描影像诊断组织学检验活体组织病理检查简称活检，方法有：细针吸取细胞学检查、穿刺活检、咬取活检、切取活检、切除活检等。今天給大家介绍一种通过分子生物学的手段来诊断乳腺癌.原癌基因HER-2/c-erbB-2/nue与v-erbB

原癌基因有高度同源性，其具有酪氨酸激酶活性，现已证实在20%～30%的乳腺癌病人中HER-2基因扩增或蛋白过表达，而大量研究表明HER-2的过表达与乳腺癌病程的进展及不良预后有关随着现代分子生物学及其相关学科的发展，目前对HER-2基因的研究已越来越受到国内外学者的重视，同时乳腺癌的治疗策略也发生了极大的变化，通过抑制细胞活化信号的传递来治疗有HER-2基因扩增的乳腺癌的药物赫塞汀(Herceptin)已通过美国FDA认证，并已成功应用于临床治疗，疗效显著。以往多采用免疫组化(IHC)方法检测HER-2蛋白的表达，荧光原位杂交(FISH)技术是近年来对HER-2基因检测的一种新方法，运用这两种检测技术对乳腺癌标本的HER-2蛋白和基因进行检测，通过两者综合的结果判定.原癌基因HER-2/neu的研究是当前热点之一。

Her-2基因是定位于染色体17q12-21的人类表皮生长因子受体2基因，编码具有细胞内跨膜酪氨酸激酶活性的跨膜蛋白P185。在人类乳腺癌中过表达率为10%～34%,其过表达与肿瘤细胞的耐药、复发、转移以及不良预后有关。该受体蛋白通过同源二聚体或异源二聚体的方式偶联，使得该信号传导通路被明显激活，从而促进肿瘤的发生发展。Her-2基因的过表达还是一个重要的临床预后指标，具有Her-2基因过表达的患者总生存期（OS）和无病生存期（DFS）较短。采用荧光原位杂交(fluorescentinsituhybridization,FISH)的方法检测乳腺癌细胞内HER22/neu的过表达,旨在探讨癌基因与临床病理状态的关系。基本原理荧光原位杂交技术是一种重要的非放射性原位杂交技术。染色体荧光原位杂交始于传统的细胞遗传学和DNA技术的结合，其基础是Southernblot原理，它的基本原理是:如果被检测的染色体或DNA纤维切片上的靶DNA与所用的核酸探针是同源互补的，二者经变性-退火-复性，即可形成靶DNA与核酸探针的杂交体。将核酸探针的某一种核苷酸标记上报告分子如生物素、地高辛，可利用该报告分子与荧光素标记的特异亲和素之间的免疫化学反应，经荧光检测体系在镜下对待测DNA进行定性、定量或相对定位分析。以半抗原如生物素、地高辛间接标记或以荧光素直接标记的已知核酸分子为探针，探针和靶序列双链DNA变性后杂交，互补的异源单链DNA分子在适宜的温度和离子强度下退火形成稳定的异源双链DNA，通过荧光标记的亲和素或抗地高辛抗体将半抗原显示出来，通过荧光显微镜观察杂交信号。

免疫组化是应用免疫学基本原理——抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素)显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学技术(immunohistochemistry)或免疫细胞化学技术(immunocytochemistry)。

众所周知，抗体与抗原之间的结合具有高度的特异性。免疫组化正是利用这一特性，即先将组织或细胞中的某些化学物质提取出来，以其作为抗原或半抗原去免疫小鼠等实验动物，制备特异性抗体，再用这种抗体(第一抗体)作为抗原去免疫动物制备第二抗体，并用某种酶(常用辣根过氧化物酶)或生物素等处理后再与前述抗原成分结合，将抗原放大，由于抗体与抗原结合后形成的免疫复合物是无色的，因此，还必须借助于组织化学方法将抗原抗体反应部位显示出来(常用显色剂DAB显示为棕黄色颗粒)。通过抗原抗体反应及呈色反应，显示细胞或组织中的化学成分，在显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物，从而能够在细胞或组织原位确定某些化学成分的分布、含量。组织或细胞中凡是能作抗原或半抗原的物质，如蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激素、核酸及病原体等都可用相应的特异性抗体进行检测。

1）特异性强。免疫学的基本原理决定抗原与抗体之间的结合具有高度特异性，因此，免疫组化从理论上讲也是组织细胞中抗原的特定显示，如角蛋白（keratin）显示上皮成分，LCA显示淋巴细胞成分。只有当组织细胞中存在交叉抗原时，才会出现交叉反应。2）敏感性高。在应用免疫组化的起始阶段，由于技术上的限制，只有直接法、间接法等敏感性不高的技术，那时的抗体只能稀释几倍、几十倍；现在由于ABC法或SP三步法的出现，使抗体稀释上千倍、上万倍甚至上亿倍仍可在组织细胞中与抗原结合，这样高敏感性的抗体抗原反应，使免疫组化方法越来越方便地应用于常规病理诊断工作。3）定位准确、形态与功能相结合。该技术通过抗原抗体反应及呈色反应，可在组织和细胞中进行抗原的准确定位，因而可同时对不同抗原在同一组织或细胞中进行定位观察，这样就可以进行形态与功能相结合的研究，对病理学领域开展深入研究是十分有意义的。特点

目前国际公认的用于检测Her-2的方法有两种：一是免疫组化法（IHC），二是荧光原位杂交技术（FISH）。免疫组化法是目前临床上常用的检测Her-2受体蛋白表达的方法，它针对Her-2的特异性抗体来检测细胞表面Her-2的表达情况。FISH用于检查17号染色体着丝粒和Her-2基因扩增情况。不少研究结果认为FISH的敏感性和特异性较高，应作为一线检测方法。然而，IHC操作简便、费用低廉，适于初筛，但多数IHC检测方法并未最佳化，而且蛋白表达与基因扩增两者本应具有一致性。材料标本来源选取乳腺癌手术切除标本，所有标本均经10%中性福尔马林固定，常规石蜡包埋。1.方法

免疫组化法（IHC）常规切片脱蜡后入PBS液，组织片入EDTApH8.

0枸橼(jǔ

yuán)酸(柠檬酸)缓冲液中行高压修复，切片浸入3%H2O210min。PBS液充分洗涤后滴加一抗于切片上，37℃烤箱孵育90min，PBS液洗5min×3次，二抗室温孵育30min;PBS

充分洗涤后DAB染色，显微镜下观察显色，达到信号强度后终止显色，苏木素衬染，脱水，透明，封片。抗原修复(Antigenretrieval，AR)技术，是指石蜡、冰冻、火棉胶、塑料切片免疫组织化学（IHC）前用胰蛋白酶、尿素、表面活性剂、微波缓冲液和金属盐等，通过机械的方法断开因福尔马林固定的导致的抗原表位和不相关蛋白间的交联键，使被掩盖的抗原决定簇或变性的抗原重新暴露或抗原性得到一定程度的恢复，使抗体更好的渗透，与表位结合。抗原修复能最大程度地恢复在制片等过程中损失的抗原性，使原来认为不能在石蜡切片上进行IHC的许多抗体获得了良好的染色结果，成为一种有效的补救措施，AR-IHC已广泛应用于临床的研究中。为什么要进行抗原修复？

(1)福尔马林固定时，组织中的许多氨基酸残基在分子内或分子间形成了醛键，使得不少抗原决定簇被封闭。

(2)甲醛的聚合作用，使蛋白质分子间相互交联形成大分子网络，也导致了抗原决定簇被掩盖，这就使得相当部分的抗原不能与抗体很好是进行反应。

为什么要抗原修复呀？高压修复操作步骤：①常规组织切片经二甲苯脱蜡、梯度酒精水化至水，待用；②取一定量0.01M柠檬酸盐缓冲液pH6.0（800～1000ml）于压力锅中，加热直至沸腾；将脱蜡水化后的组织切片置于不锈钢或耐高温塑料切片架上，放入已沸腾的缓冲液中，盖上锅盖，扣上压力阀，继续加热至喷气，开始计时1－2分钟后，压力锅离开热源，冷却至室温（稍冷后，可在自来水龙头下加速冷却），取出切片，先用蒸馏水冲洗两次，之后用PBS（pH7.2－7.4）冲洗两次，每次3分钟。进行组化的下一步。（3）注意事项：①加热时间长短的控制很重要，从组织切片放入缓冲液到高压锅离开火源总时间控制在5－8分钟为好，时间长可能会使染色背景加深。②必须使用不锈钢或耐高温塑料切片架，不能使用铜架，以防缓冲液pH值增高导致组织脱片。③高压锅离开火源后必须等缓冲液冷却后，才能把切片取出。④为防止组织脱片，玻片必须经清洁处理后，包被0.01％多聚赖氨酸（poly-L-lysine）或APES(3-aminopropyl-triethoxysilane)。⑤缓冲液的量必须保证所有切片都能浸泡到，避免切片干涸（抗原可能完全丢失）。用过的柠檬酸缓冲液不能反复使用。

PBS的清洗方式选择、次数和时间的选择？（1）单独冲洗，防止交叉反应造成污染。临床上每天检测的病例很多，所用的抗体种类及项目也多，如果在加入一抗孵育完后，将它们在一个缸内洗，这样就会造成交叉污染，影响最后的结果。正确的做法是单独地进行冲洗，冲洗的PBS为一次性，保证切片没有相互交叉污染的机会。（2）温柔冲洗，防止切片的脱落。冲洗切片，取出切片，将PBS从上轻轻地冲洗，让PBS自上而下流下来，不要拿起切片将PBS对准切片冲洗，这样由于冲出的PBS有一定的冲击力，很容易使切片周边引起松动，导致切片的脱落。（3）冲洗的时间要足够，才能彻底洗去结合的物质。DAB显色时间如何把握？（1）DAB显色时间不是固定的，主要由显微镜下控制显色时间，到出现浅棕色本底时即可冲洗；（2）DAB显色时间很短（如几秒或几十秒）就出现很深的棕褐色，这很可能说明你的抗体浓度过高或抗体孵育时间过长，需要下调抗体浓度或缩短你的抗体孵育时间；（3）此外，若很短时间就出现背景很深，还有可能你前面的封闭非特异性蛋白不全，需要延长封闭时间；（4）DAB显色时间很长（如超过十几分钟）才出现阳性染色，一方面可能说明你的抗体浓度过低或孵育时间过短；另一方面就是封闭时间过长。复染：目的是形成细胞轮廓，从而更好地对目标蛋白进行定位，经常用苏木素复染（胞核染料）。

封片：封片：为了长期保存，我们一般用中性树胶等封片，避免产生气泡，方法是直接在载玻片组织上滴一滴封片液，然后一手拿住盖片某一拐角，而另一手拿对面的那个拐角，接近封片液近端的拐角先降低，直至接触到液体时为止；当发现液体接触面在不断弥散时，则可以缓慢降低另一拐角，这样一般不会产生气泡。荧光原位杂交技术（FISH）组织切片，65℃过夜烘烤，二甲苯室温脱蜡2次，每次10min，随后浸入100%乙醇中5min，复水后50℃下30%酸性亚硫酸钠处理20~30min，2×SSC漂洗2次，每次5min，浸泡在蛋白酶K工作液中，37℃下孵育7~8min，2×SSC溶液漂洗后一次经-20℃预冷的70%、85%、100%乙醇各2min脱水，丙酮浸泡2min，干燥，加盖玻片至78·56℃3min；将玻片在变性液中浸泡5min，预冷的70%、85%、100%乙醇中各3min梯度脱水，45℃~50℃预热2~5min后与探针在42℃保温箱中过夜杂交；玻片用甲酰胺洗涤，暗处自然干燥后经二脒基苯基吲哚荧光染料（DAPI）复染，暗处放置20～30min后荧光显微镜下选用合适的滤波片观察玻片。实验流程

2.结果判定荧光原位杂交结果:计数30个细胞核内橘红色的HER22/neu基因荧光信号和17号染色体的绿色荧光信号,统计其比例(比例30个细胞核中红信号总数/30个细胞核中绿信号总数)。<1.8为阴性结果,>2.2为阳性结果,提示样本中HER22/neu基因扩增。若比例在1.8～2.2之间,则增加计数细胞100个或重作计数。免疫组化结果:以细胞膜棕黄色染色为阳性判断标准,染色被分为0～3+(4级)。肿瘤细胞无染色为0,细胞膜弱染色或非连续性染色、未环绕整个细胞膜为1+,细胞膜中等程度连续性染色为2+,强染色为3+。图1免疫组化法阴性Fig1ThenegativeresultsofIHC全部瘤细胞中细胞膜无染色或少于10%的肿瘤细胞膜染色(－)图2免疫组化法+Fig2TheweakpositiveresultsofIHC大于10%的瘤细胞呈现微弱、不完整的细胞膜着(+)图3免疫组化法++Fig3ThemoderatepositiveresultsofIHC瘤细胞细胞膜呈现大于10%轻度至中度完整染色结果为(++)图4免疫组化法+++Fig4ThestrongpositiveresultsofIHC瘤细胞细胞膜大于10%完全强染色结果为(+++)提示该样本无Her-2基因扩增（图5）提示样本中Her-2基因扩增（图6）Her2探针：红色荧光对照探针：绿色荧光图1

FISH法检测HER22/neu基因(+)Fig.1

HER22/neu(+)byFISH图2

FISH法检测HER22/neu基因(-)Fig.2

HER22/neu(-)byFISH表118例29～50岁年龄组乳腺癌患者C-erbB2蛋白表达水平和Her-2基因扩增情况

Tab2TheexpressionlevelofC-erbB2proteinandtheamplificationofHer-2genein118breastcancerpatientsaging29~50IHC检测结果－++++++合计FISH-44（89.8%）30（75.0%）4（28.6%）2（13.3%）80FISH+5（10.2%）10（25.0%）10（71.4%）13（86.7%）38合计494014151183讨论国外资料显示，在乳癌患者中，大约有25%~30%的患者会有Her-2蛋白的高表达，而这其中90%~95%的蛋白高表达是由于Her-2/neu基因扩增引起的。在药物的临床应用过程中，对Her-2表达的检测是至关重要的。原癌基因HER22/neu位于17号染色体q2l,其状态在各期乳腺癌中长时间保持稳定,过表达激活后,可加快细胞增生、缩短细胞周期、增强恶性表现并出现抗凋亡及对多种化疗药物产生耐药现象

。乳腺癌患者中Her22/neu过表达约15%～30%,过表达者化疗、激素治疗效果及预后均相对较差。抗HER22单克隆抗体“Herceptin”(赫赛汀)能抑制HER22过表达的乳腺癌细胞,是第一个基因靶向治疗乳腺癌的药物,在美国现已批准临床使用,但要求必须用FISH技术检测出HER22基因扩增才可使用,HER22的检测已进入基因时代。HER22/neu阳性者细胞间的黏着力较小,使肿瘤细胞更易扩散转移。免疫组化法（IHC）是目前临床上常用的检测Her-2受体蛋白表达的方法。它是针对Her-2的特异性抗体来检测细胞表面Her-2的表达情况，该方法简便、价廉、可重复性好、对材料的要求不高，在临床上广泛应用。但IHC检测对象是Her-2受体蛋白，在标本固定和处理中可能会使蛋白质变性破坏而影响检测结果，还有17号染色体的非整倍体现象会使检测出现假阳性的结果，加上结果主观判读的误差等，可直接影响结果的可靠性。荧光原位杂交技术（FISH）是用于检查17号染色体着丝粒和Her-2/neu基因扩增情况的乳腺癌诊断新技术，染色体的稳定性比蛋白质好得多，所以FISH技术在实验过程中受到的影响较小。加之FISH技术可以定量判读结果，所以此技术敏感性和特异性高、简便快速，可以分析基因缺失、扩增和重排，还可以避免17号染色体的非整倍体现象使结果假阳性，已被公认为检测Her-2基因过表达的金标准。在进行FISH时也会受到一些因素的影响，比如蛋白消化不当、烤片温度过高等，可使荧光信号减弱或无信号等。为确保消化充分，我们在实验中自然干