全基因组关联分析影响猪GLU和GSP的染色体位点,畜牧兽医论文

全基因组关联分析影响猪GLU和GSP的染色体位点,畜牧兽医论文【研究意义】血液中的血糖〔glucose，GLU〕循环全身，对人体具有重要的生理功能，是反映机体生理状况的一个重要指标。空腹血糖浓度〔fastingserumglucose,FSG〕是糖尿病临床诊断的常规指标，也是糖尿病诊断后10年内因心血管疾病死亡的独立预警指标。糖尿病病人的空腹血糖浓度持续偏高，波动较小，是一种营养代谢性疾病。有研究表示清楚，空腹血糖浓度是可遗传的，遗传力为0.620.08〔P＜0.01〕，属于高遗传力性状。糖基化血清蛋白〔glycosylatedserumproteins，GSP〕是一个比血糖更稳定、更能反映机体23周内平均血糖水平的指标。猪作为形式动物，与人类具有类似的代谢功能、心血管系统、成比例的器官大小等，已经成为研究人类肥胖、糖尿病及并发症等疾病的最佳形式动物。研究影响猪GLU和GSP的染色体位点及候选基因定位，不仅对猪代谢生理功能的遗传解析具有重要意义，而且对人类相关疾病的临床研究具有参考价值。【前人研究进展】近年来，已定位了多个影响GLU和GSP的QTL。Cai等在对西班牙裔儿童研究中发现，影响空腹血糖浓度的QTL定位在13号染色体的8599cM处；An等在人19号染色体的88cM处定位到了显着影响空腹血糖浓度的QTL，在7号染色体的163cM处定位到了染色体可显着影响空腹血糖浓度的QTL；Kobayashi等在由SMSMXA-5构建的F2小鼠中，在8号染色体上定位到了影响空腹血糖浓度的QTL。人和鼠的血糖性状QTL定位结果具有很高的一致性。在对猪的研究中，Yoo等利用长白韩国本地猪种F2群体，在SSC1和SSC8上定位到染色体可显着影响GLU的QTL；Dsauts等利用梅山猪和大白猪构建的F2群体在SSC1、3、5、8四条染色体上定位到了影响GLU浓度的QTL；陈蓉蓉等在白色杜洛克二花脸资源家系SSC14的68cM处定位到了1个5%基因组显着影响GLU的QTL。由猪QTL数据库可知，影响GSP的QTL定位较少，当前只要在SSC4的54cM处发现一个染色体显着水平QTL。【本研究切入点】当前，尚未见利用Illuminaporcine60KSNP芯片进行全基因组关联分析定位影响猪GLU和GSP染色体位点的研究报道。【拟解决的关键问题】本研究利用猪60KSNP芯片，通过全基因组关联分析来定位影响猪GLU和GSP的染色体位点，为进一步鉴别影响猪GLU和GSP的主效基因和因果突变位点提供研究基础，为人类低血糖症和糖尿病的遗传学研究提供参考。1材料与方式方法本试验于2018年3月至2020年9月在江西农业大学动物生物技术国家重点实验室培育基地进行。1.1试验动物试验猪为中国培育猪种苏太猪和江西农业大学动物生物技术国家重点实验室培育基地构建的白色杜洛克二花脸F2资源家系。F2资源家系以2头白色杜洛克公猪和17头二花脸母猪为F0始祖，杂交产生F1代。随机选择9头F1公猪和59头F1母猪，分六批次共繁育1912头F2个体，华而不实760头F2个体〔411头公猪，349头母猪〕屠宰时采集血液，分离血清用于GLU和GSP测定。所有F2仔猪46d断奶，公猪90d阉割。435头苏太猪〔228头公猪和207头母猪〕购自苏州市苏太育种中心，18d阉割，28d断奶。两品种猪按统一常规方式方法饲养，采食一样饲料，自由采食和饮水。〔2405〕日龄禁食禁水24h后进行屠宰取样。1.2血清GLU和GSP含量测定血液样品在室温下静置5h，4℃3000r/min离心20min，分离血清保存于-80℃待测。血清样品送至南昌大学第一附属医院使用全自动生化分析仪〔AU5421，美国贝克曼库尔特〕测定GLU和GSP含量。1.3DNA提取及60KSNP芯片判型采集0.51.0g猪耳组织，根据常规酚/氯仿法提取基因组DNA。用NANODROP1000核酸蛋白分析仪〔ThermoScientific，USA〕测定DNA浓度和质量，A260/280的比值在1.82.0断定合格，将浓度统一稀释至20ngL-1，-20℃冰箱保存。DNA样品利用IlluminaBeadArraySNP基因分型平台进行猪60KSNP芯片分型〔北京怡美通德科技发展有限公司〕。利用PLINK软件对SNP进行质控，将检测率95.0%、次等位基因频率〔minorallelefrequency〕0.05且符合家系分离规律的SNP标记用于后续的统计分析。1.4统计分析采用广义线性混合模型断定各个SNP与表型性状之间关联性，分析模型为：y=+Xb+Sc+Z+e。华而不实，为性状平均值，b为性别和批次的固定效应向量，c为其余的微效应，为随机加性遗传效应向量，e为残差，X、S和Z是对固定效应和随机效应的关联矩阵，y为所测得的表型值，利用R语言中的GenABEL软件包进行GWAS分析。整合F2资源家系和苏太猪共有的34495个通过质量控制的SNP进行GLU和GSP性状的MetaGWAS分析，当自由度为3时，根据每一个SNP位点在每个群体中的卡方值〔x2〕计算合并的新的x2值，利用Bonferroni校正多重检验确定显着性阈值，基因组显着水平阈值为0.05/有效SNP数量，染色体显着水平阈值为1/有效SNP位点数量。1.5位置候选基因搜索利用Ensemb或NCBI猪参考基因组数据库中搜索关联性显着的SNP所在区域的已经知道基因信息，根据基因注释情况分析可能的位置候选基因。2结果2.1血清GLU和GSP含量测定苏太猪和F2资源家系血清GLU和GSP含量测定结果见表1。两个群体通过质控的有效表型数据个体数分别为682头和393头；从表中能够看出，F2资源家系血清平均GLU浓度高于苏太猪，平均GSP浓度低于苏太猪。【表1】2.2全基因组关联分析GLU和GSP两性状的全基因组关联分析结果见表2。本试验共检测到3个SNP位点与GSP相关，2个SNP位点与GLU相关，这些SNP与表型的关联性只到达染色体显着水平。【表2】在白色杜洛克二花脸F2资源群体中，10号染色体上的SNPALGA0057739与血清GSP含量的关联性达染色体显着水平〔P=1.5810-5，图1〕，该SNP解释表型变异为3.72%，位于染色体24.67Mb处，ASPM基因距离该SNP近期〔10.33kb〕。在苏太猪群体中，检测到两个与GSP达染色体显着水平的SNP〔ALGA0108699和DRGA0017552，P=1.4510-5，图2〕，SNP所解释的表型变异均为3.72%。使用猪10.2版本参考基因组序列，这两个SNP均无法定位到详细的染色体位置〔表2〕。通过人、猪比拟基因组分析发现，这两个SNP均位于SSC8，处于STPG2基因3下游180.3193.0kb处。将两个试验猪群体合并，对GSP性状进行Meta分析，并未发现与GSP显着相关的SNP位点〔图3〕。在白色杜洛克二花脸F2资源家系和苏太猪两个群体中分别进行GWAS分析，并未定位到与血清GLU含量显着相关的SNP。两个群体进行Meta分析时，1号染色体250.32Mb处的SNPDRGA0002021与GLU的关联性达染色体显着水平〔P=2.4810-5〕，SNP位于TRPM3基因内；在14号染色体43.97Mb处也分析得到一个达染色体显着水平的SNP〔ASGA0062984，P=1.2910-5〕，SNP位于KCTD10基因内〔图4〕。3讨论本试验在苏太猪和F2资源群体检测到3个SNP与血清GSP含量显着相关，但定位结果与Chen等在一样F2资源群体中基于194个微卫星标记的QTL定位结果不一致。QTL定位分析与全基因组关联分析是不同的，首先QTL定位分析是基于QTL的两个等位基因在F0始祖中固定这个假设基础上进行的，全基因组关联分析无此假设，因而即便QTL在始祖中分离，GWAS也能检测到该显着性位点；在GWAS分析中，仅考虑了加性效应，而在QTL定位中同时考虑了加性和显性效应；GWAS分析中使用的SNP标记的密度远大于194个微卫星标记。在苏太猪和F2资源群体中检测到的与GSP显着关联的SNP不一致，表示清楚影响GSP的染色体位点存在群体异质性。本试验在苏太猪和F2资源群体中均未检测到与GLU显着相关的SNP，可能是群体样本数量缺乏导致。本试验获得的关联性显着相关的SNP其解释的表型变异5%，要检测到效应较小的染色体位点需要较大的群体规模。另外与GSP相比，血清中GLU的含量更易遭到环境等因素的影响。对于某些染色体位点，假如对不同群体同一性状具有一样的作用，通过合并不同群体进行Meta分析能够起到增加群体样本规模的作用，有可能发现新的显着性位点。本试验合并两个群体进行两个性状的Meta分析，结果在SSC1和SSC14定位到了2个与GLU显着关联的SNP，华而不实SSC14上显着关联的SNP位于Chen等报道的影响GLU的QTL置信区间内，SSC1上定位到显着关联的SNP与Dsauts等报道的影响GLU的QTL处于同一染色体区域。Meta分析未发现新的与GSP显着相关的SNP。利用猪参考基因组信息〔10.2版〕，搜索了离关联性最强SNP近期的基因。对于SSC10，24.67Mb处显着影响GSP的SNP，在Ensembl上搜索到ASPM基因离其近期〔10.33kb〕，在GeneCards搜索这个位置候选基因的功能，发现ASPM可通过调节Wnt信号通路而影响大脑发育，Wnt信号通路与糖尿病密切相关，因而ASPM基因是该染色体区域的重要候选基因。SSC1上与GLU显着关联的SNPDRGA0002021位于TRPM3基因内，TRPM3与钙离子通道介导的钙离子进入细胞有关，在钙离子介导的非选择性通道中广泛表示出，TRPM(melastatin)与血糖稳态和代谢综合征相关。Wagner等研究小鼠胰腺细胞信号转导时发现，TRPM3基因介导孕烯醇酮磷酸化刺激胰岛素分泌，TRPM3基因调节胰岛素的分泌和生物合成。因而，TRPM3是与GLU相关的一个重要候选基因。对于SSC14，43.97Mb上与GLU显着关联的ASGA0062984位于KCTD10基因内，KCTD10基因与MVK、MMAB基因严密相邻，已证实含有该基因的基因调控网络与糖尿病、肥胖、动脉粥样硬化相关，是一个重要的候选基因。离SSC8与GSP显着相关的SNPALGA0108699和DRGA0017552近期的STPG2