多糖的提取分离纯化和结构分析

多糖的提取、分离纯化和

结构分析一、前言

多糖和蛋白质、基因是生命科学的三大领域，是自然界含量丰富的物质，也是与人类生活紧密相关的一类生物高分子。大量研究表明，多糖具有其独特的生物活性，是许多天然产物的主要活性成分，具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤、抗辐射、抗衰老等功效。多糖的提取、分离和纯化是研究多糖结构和活性的基础，只有得到相对纯度较高的多糖组分，才能更好地分析其结构，从而探究其重要的生理功能。多糖的提取

虽然多糖的来源不同，但其提取、分离和纯化的方法是基本一致的。天然原料粉碎后，先经过乙醚或石油醚回流萃取的脱脂处理，再在热水中浸提得到水溶性的组分，经乙醇反复沉淀、脱色和脱蛋白后，透析去除小分子杂质，从而得到多糖的粗品；粗多糖再经过离子交换柱和凝胶柱的分级纯化后得到不同组分的多糖纯品，可用于进一步的结构和活性研究。多糖的提取提取：将多糖化合物从生物体内分离出来的过程。提取一般采用溶剂抽提，所依据的原理是极性相似相溶原理，先将原料用乙醇或自主回流脱脂后，根据多糖的特性用水、稀碱或稀酸提取，同一原料，用水、酸、碱提取得到的多糖成分是不尽相同的。为防止多糖中糖苷键的断裂，提取应尽量避免在酸性条件下进行，如用酸提，提取时间宜短，温度不超过50ºC；多糖的提取

稀碱提取时，常需要通入氮气或加入硼氢化钠或硼氢化钾，以防止多糖降解。为了提高提取的选择性，尽量使杂质的溶解度降到最低限度，通常在提取液中加入某些物质，如乙酸、乙醇、苯酚、盐类等物质；为了增加提取效率，缩短提取时间，还可以在提取过程中使用超声波、微波或一些酶进行辅助提取，但需要注意的是，外加的物理场或酶处理会对多糖的结构产生一定的影响。多糖的分离纯化（1）多糖的初步分离纯化：多糖的分离和醇化是出去多糖粗提物中非多糖组分并得到单一的多糖组分，经过有机溶剂沉淀得到的粗多糖一般含有一些游离的蛋白质和一些小分子，因而需先对粗多糖进行初步的分离纯化。脱蛋白质方法包括：醇洗或丙酮洗Sevag法三氟三氯乙烷法

三氯醋酸法脱酚类化合物方法包括：弱碱性树脂DEAE-纤维素或DuoliteA-7吸附色素氧化脱色法(浓氨水、pH8、50ºC、过氧化氢、2h)多糖的分离纯化（2）多糖的分级纯化：经脱色、脱蛋白和透析等处理得到的粗多糖大多是由几种多糖所组成的，因此应采用适当的方法对粗提物进行分离纯化，将混合多糖分离成为单一多糖。

目前，用于多糖分离纯化的手段主要有包括：分步沉淀法、季铵盐沉淀法、盐析法、金属配合物法、柱色谱分离法、超滤法和电泳法。国内外，应用比较广泛的主要是超滤法和柱色谱分离法。多糖的分离纯化超滤法：在常规微粒过滤的基础上发展起来的细微粒子过滤技术，是膜法分离的一种，其原理是，不同孔径的超过滤膜排阻不同分子量和形状的多糖而得到分离。规格：超滤孔径1~100nm，截留分子量103~106特点：受渗透压的阻碍作用小，在相当低的压力差(0.04~0.7MPa)下保持高流通率。应用：各类多糖的分离、浓缩、纯化优点：收率高、不易破坏多糖生物活性、能耗低，适于工业化生产。多糖的分离纯化柱色谱法：一种物理的分离方法，利用混合物中各组分的物理化学性质的差别，使各组分以不同程度分布在两相(固定相和流动相)中，使各组分以不同速度移动而分离。规格：根据其电荷性质和结构特点选择，常用柱色谱包括离子交换色谱柱和凝胶柱色谱。特点：分离效率高、设备简单、操作方便、条件温和、不易造成物质变性等优点。应用：物质分离纯化、分析鉴定最重要的方法之一；分离/有机化合物及生物大分子不可缺少的手段。多糖的结构分析多糖的结构：多糖的结构是其生物活性的基础，多糖的结构分析在多糖的研究中具有非常重要的地位，是糖化学的核心所在。

与蛋白质、核酸大分子相比，糖链的结构也包括一级结构、二级结构和二级以上的高级结构，但其结构的含义和内容都较蛋白质、核酸要复杂和丰富得多。多糖的结构分析糖链结构的研究基础是一级结构：

1、糖链中糖残基的种类、环型及分子数比例；2、糖链的分子量；3、糖链中糖残基之间的连接位置；4、糖链中糖残基之间的连接顺序；5、糖链中每个糖残基的构型；6、糖链分支点的位置、分支点上糖残基结构；7、糖链复合物中的糖链与非糖部分的连接点结构。多糖的结构分析1、糖链中糖残基的种类和及分子比多糖完全酸水解部分酸水解乙酰解和甲醇解单糖糖链片段乙酰化多糖甲酰化多糖纸色谱PC薄层色谱TLCGCHPLC离子色谱中和过滤衍生多糖的结构分析2、多糖分子量的测定经典的测定高分子化合物分子量的许多物理方法均适用于多糖类分子量的测定，如渗透压法、蒸汽压渗透计法、端基法、HPLC、黏度法、凝胶色谱法和超滤法等，其中目前公认较好的方法是高效凝胶渗透色谱（HPGPC）。高效凝胶渗透色谱又称高效尺寸排阻色谱（HPSEC）、高效凝胶色谱，是一种高分子领域的高效分离分析技术，是研究高分子的分子量及合成高分子分子量分布及与分子线团尺寸相关的结构、反应、物性的最有效的手段之一。常用的商品柱有Bondagel和TSK柱系。多糖的结构分析3、糖链中糖残基间的连接位置分析（1）甲基化分析方法：确定糖链中糖基间的连接位置常用方法。该法首先将多糖链全甲基化，使所有的游离羟基变为甲氧基。目前最常用的甲基化方法是改良Hakomori法。Hakomori法先将样品溶于无水二甲基亚砜中，然后与甲基亚磺酰甲基钠SMSM反应，使得多糖上游离羟基离子化，多糖成为阴离子后，易于CH3I反应，该法通常需重复数次。以α-(1-4)葡聚糖为例说明甲基化过程。多糖的结构分析3、糖链中糖残基间的连接位置分析（2）酶水解法：由于酶促反应具有高度专一性且副产物少的特点，酶水解法是糖链的结构分析中的一种重要手段，利用α-糖苷酶和β-糖苷酶对多糖底物的催化反应来确认多糖链中糖苷键类型，还可以利用酶学方法分析糖肽连接方式。

美国Maley和Tarention发现内切β-N-乙酰氨基葡萄糖糖苷酶作为稀释放酰胺连接的糖链的工具酶，为研究与天冬酰胺连接的寡糖结构开辟了新纪元。多糖的结构分析4、糖链中糖残基连接顺序分析（1）化学水解法（2）高碘酸氧化法和Smith降解（3）光谱学法（MS和NMR）多糖的结构分析（1）化学水解法最初用化学降解法，如稀酸（含有机酸）缓和水解，部分酸水解，也可用乙酰解、碱水解和酸解，将糖链水解成较小的片段（各种低聚糖），利用柱色谱分离、纯化，分别测定这些低聚糖的结构，分析其连接顺序，从而可推断出整个糖链（或重复单位）的连接顺序。由于水解方法各不相同，作用的糖苷键也不同，因为生成的低聚糖亦各不相同，这有利于分析与判断糖链中糖残基间的连接顺序。例如，利用甲基化分析方法得知黑霉多糖有等量的α-(1-3)和α-(1-4)连接的D-吡喃葡萄糖，水解得到麦芽糖、黑霉糖和两种三糖，但无麦芽糖和黑霉三糖。多糖的结构分析（2）高碘酸氧化法和Smith降解法高碘酸可以选择性地氧化断裂糖分子中的连二羟基或连三羟基处，生成相应的多糖醛、甲酸，反应定量地进行。1-2，1-4键合，每糖基消耗1分子高碘酸，无甲酸生成；1-6键合，每糖基消耗2分子高碘酸，生成1分子甲酸；1-3键合，不能被高碘酸氧化。反应必须在控制的条件下进行，以避免副反应的产生。一般使多糖与最小量的高碘酸反应，溶液pH控制在3～5，且避光、低温，同时需做空白实验。Smith降解是将高碘酸氧化产物还原后进行酸水解或部分水解。高碘酸氧化后生成不同的产物，降解产物得更多信息。多糖的结构分析（3）质谱MS法20世纪50年代，因糖的难挥发性和热不稳定性，限制了电子轰击质谱(EI-MS)对多糖的研究。糖的衍生化方法能提高其挥发性和热稳定性，用于结构解析，但对于聚合度高的多糖仍存在上述问题。近年来发展了各种软电离技术，如化学电离CI、场致电离FI、场解析电离FD、化学解析或直接化学电离DCI、快速电子轰击法FAB以及电喷雾电离质谱ESI-MS和基质辅助激光解析质谱MALDI-MS、用飞行时间TOF检测器来检测。应用质谱技术如联动扫描、MS/MS方法、不同衍生化处理、同位素标记方法、GC-MS和LC-MS以及各种软电离技术的配合使用，在序列分析中越来越重要。多糖的结构分析5、糖苷键的构型、环型分析（1）红外光谱（2）核磁共振多糖的结构分析（1）红外光谱法不同糖的鉴别：吡喃糖α-D-葡萄吡喃糖855~833cm-1、β-D-葡萄吡喃糖905~876cm-1，α-D-半乳吡喃糖839~810cm-1、β-D-半乳吡喃糖914~886cm-1，α-L-甘露吡喃糖843~818cm-1、β-D-甘露吡喃糖898~888cm-1，β-D-阿拉伯吡喃糖和β-L-阿拉伯吡喃糖898~888cm-1，α-D-木吡喃糖839~810cm-1。吡喃糖和呋喃糖的鉴别：D-葡萄吡喃糖的C-O-C骨架非对称和对称伸缩振动分别在917和770cm-1左右；而呋喃环相应吸收峰在924和879cm-1左右。多糖的结构分析（1）红外光谱法糖苷键及糖构型的确定：α-D-(1-4)和α-D-(1-3)交替结合，随聚合度的增加，环伸缩振动的吸收峰向高波数移动，而大多数是α-D-(1-6)结合键的葡聚糖和异麦芽糖没有明显移动。此外，甘露吡喃糖、半乳吡喃糖在875cm-1有新的吸收峰，甘露糖还有810cm-1特征吸收峰。糖键上主要取代基的鉴别：氢键3600~3200cm-1出现一宽峰；酰化或醚化，这组峰消失。一般来说，分子内氢键在3560cm-1左右，分子间氢键在3400cm-1以下。磷酸基在1300~1250cm-1有P=O伸缩振动，磺酸基在1240cm-1有S=O伸缩振动，酰胺1650和1550cm-1。多糖的结构分析（2）核磁共振NMR法1970s引入多糖结构研究