动物疫病监测的采样技术(潘)

重大动物疫病采样技术

潘国利县动物疫病预防控制中心

重大动物疫病采样技术

一、畜禽血液和病料采集技术（一）畜禽血液采集技术（二）畜禽病料采集技术

一、畜禽血液采集技术（1）（一）、血样采集要求1、所有采血用具均应事先以消毒、干燥处理；2、采血部位要进行剪毛、清拭并按常规进行消毒（先碘酊后酒精）；3、怀疑传染病时，采血过程要防止到处流散，检后的残余血液及所用器皿要进行消毒处理；4、需抗凝的要加入抗凝剂。常用的抗凝剂有：一、畜禽血液采集技术（2）①双草酸盐抗凝剂：草酸钾0.6克；草酸铵1.2克；蒸馏水加至100毫升，溶解后，吸取0.5毫升，加入供采血用的试管或小瓶中，置干燥箱内（温度不能超过80℃），烘干备用（实际含草酸盐10毫克，可供5毫升全血抗凝用）；②枸橼酸钠6mg可使1ml血液不凝固，或配成3.8%的溶液。适用于血钙的测定和血沉测定时的抗凝；一、畜禽血液采集技术（3）③乙二胺四乙酸二钠（EDTA二钠）每10毫克可使5毫升全血抗凝；或配成10%的溶液，每2滴可使5毫升全血抗凝；④肝素对血中有机成分和无机成分测定均无影响，多用于科研。常用肝素钠配成1ml内含1mg(0.1%)的水溶液，取0.1ml分装于小试管或小青霉素瓶中，在80℃以下烤干后备用，可使5～10ml血液不凝固。一、畜禽血液采集技术（4）5、需分离血清的血液（不抗凝），试管要静置、斜放，便于血清晰出；6、注意安全。一、畜禽血液采集技术（5）（二）牛静脉血液的采集1、颈静脉采血器械：酒精、碘酊药棉；5ml或10ml试管，试管架；12～16＃针尖；毛剪、止血钳、镊子；3～4米细绳1根。保定：站立保定。一、畜禽血液采集技术（6）助手：至少2人。部位确定：一般在颈静脉沟的上1/3和中1/3交界处的颈静脉内（两侧均可）。颈静脉沟位于颈下侧，由臂头肌和胸头肌形成的一肌沟，外表肉眼可见。牛颈静脉位置如下图示：操作：助手保定好牛头。先看（摸）清颈静脉沟，确定部位，局部剪毛（看不清时）、消毒。以左手拇指（于左侧操作时）或中指和无名指（于右侧操作时）按压颈静脉沟的中下部，或一、畜禽血液采集技术（7）让助手用细绳横勒颈中下部，稍等片刻，让颈静脉充分怒张，右手持针头在注射点按静脉走向，与静脉呈45°角斜向迅速刺入。若牛皮较厚，指力有限，用此法常感困难时，可手持针头，依靠腕力把针头朝静脉方向快速地垂直刺入，当刺入静脉内，立见回血，即可用试管接之。若针头偏离静脉（未见回血），可将针头稍稍退出或拔至皮下，在认清静脉一、畜禽血液采集技术（8）走向后重新刺入。一般来说，只要刺入静脉，针头内滴出之血液可有5～10毫升，若滴出之血液量较少或较慢，可用手指按压颈静脉中下端片刻即可。采血完毕，迅速拔出针头，用碘酊棉球按压针孔片刻即结束。颈静脉血液的采集图片一、畜禽血液采集技术（9）2、尾静脉采血器械同上。

保定：站立保定。部位确定：尾根腹侧中部。操作：助手立于牛的右侧，将尾声轻轻抬起，使之基本与地面平行，采血者立于牛的左一、畜禽血液采集技术（10）侧，手持装有针头的注射器，使针头与尾椎纵轴成45°角，向上向前方刺入约1～2cm，边刺边旋动注射器活塞，见血即可。采血完毕，迅速拔出针头，局部按压、消毒。

尾静脉采血一、畜禽血液采集技术（11）（三）猪静脉血液的采集

1、耳静脉采血（多用于大猪采血）器械准备：酒精、碘酊药棉；5ml或10ml试管，试管架；毛剪、止血钳、镊子；配7＃针尖的一次性注射器。保定：左侧（或右侧）横卧保定。

一、畜禽血液采集技术（12）部位确定：耳下缘1/2处。操作：耳静脉局部常规消毒处理。助手用手指捏压耳根部静脉血管，使静脉充盈、怒张。术者用左手的食指和中指在耳下将耳上托，拇指在上部把注射点皮肤展平，右手持注射器把针头对准血管（针头与血管成30～45°角）刺入，当初步判定针尖已刺入血管后，将注射器一、畜禽血液采集技术（13）放平，顺血管走向伸入（此时感觉针尖阻力明显减小），同时抽动注射器活塞，慢慢抽取血液。如血管内血量较少，助手可用手指自耳根向耳尖部挤抹。采血完毕，迅速拔出针头，局部用干燥棉球按压止血。

一、畜禽血液采集技术（14）2、前腔静脉采血器械准备：酒精、碘酊药棉；5ml或10ml试管，试管架；毛剪、止血钳、镊子；配7＃长针尖的一次性注射器。保定：仰卧保定，两前肢与体中线垂直，两后肢后引，头部贴地，使前腔静脉怒张。熟练时也可取半仰卧、侧卧或站立保定。一、畜禽血液采集技术（15）部位确定：刺入点右侧或左侧胸浅窝内，即在第一肋骨和胸骨柄（胸骨的前端）结合处前方。亦有人刺入点定位于耳根与胸骨柄连线上，胸骨柄前1～2指宽处。操作：右手持针，针头斜向对侧或向后内方（与胸骨纵轴基本成45°角），与地面成60°角，刺入2～5cm深（视猪只的大小定），针头向刺入的同时，微微抽动活塞，使注射器形一、畜禽血液采集技术（16）成负压，一旦进入前腔静脉，立见血液涌入注射器。完毕后常规消毒。需要说明的是，刺入点一般取右侧，因左侧靠近膈神经而易损伤。采血图片前腔静脉采血图片前腔静脉采血图片一、畜禽血液采集技术（17）家禽血样的采集

1、鸡翅内侧静脉采血器械准备：酒精棉球；小试管或细塑料管，试管架；镊子；配5～7＃针尖的一次性注射器。一、畜禽血液采集技术（17）保定：手提保定。助手一手抓住两只鸡腿，一手抓鸡翅根部，以拇指按压静脉管。部位确定：鸡翅内侧腋静脉，肉眼可见。操作：助手抓住鸡翅根部，以拇指按压静脉管，使之充盈。术者左手大拇指捏住鸡翅内侧，余四指捏住鸡翅外侧，展平鸡翅，右手持针，沿血管方向，于血管傍先刺入皮下，然后

一、畜禽血液采集技术（18）再斜刺向血管，抽取血液（此法避免拔针后出血过多）。也可直接刺向血管，抽取血液（采用此法，拔针后要用干棉球按压数分钟止血）。或者将鸡翅摆平，直接先将静脉用针刺破，待血液流出后，用细塑料管利用虹吸的原理吸取血液，事毕，用火将细塑料管一头封闭。鸡翅内侧静脉采血图片一、畜禽血液采集技术（19）2、鸡心脏采血方一操作要点：鸡左侧向上横卧保定，拔去胸上部部分羽毛，寻找由胸骨走向肩胛的皮下大静脉，心脏约在该静脉的分支下侧，有时用食指可摸到心脏跳动。用酒精消毒后，以碘酊标记部位。针头（7＃）刺入时，如触及胸骨可稍拔出，使针头稍向右偏，避开胸骨，再将针头向里刺入，边刺边抽动活塞，若刺入心脏，便有血液涌入注射器，术毕，局部消毒。一、畜禽血液采集技术（20）方二操作要点：鸡仰卧保定，鸡头部朝向术者，拔去胸上部少许羽毛，用手指在胸骨上方、嗉囊下方摸得一凹窝，右手持针（7＃），自胸骨上方凹窝斜向前下方心脏方向（鸡的左侧、术者的右侧）刺入，边刺边抽动活塞，若刺入心脏，便有血液涌入注射器，术毕，局部消毒。注意：此法（含方法1、2）采血后，多会引起鸡只死亡，仅适用于淘汰鸡的采血。一、畜禽血液采集技术（21）3、鸡头部静脉窦采血器械准备：酒精或碘酊棉球；小试管，试管架；镊子；配5－7＃短针尖的一次性注射器。保定：助手一手抓鸡的两只腿，一手抓鸡的两翅，使头部向上。术者左手食指和中指夹住鸡喙，大拇指压住颈上部，以此固定头部。部位确定：鸡头后部，枕骨大孔为刺入点。一、畜禽血液采集技术（22）操作：鸡只如上述方法确切保定后，枕骨大孔部少许拔毛，消毒，术者右手持针，自枕骨大孔进针，针头对准喙尖，约与颈椎纵轴成45°角，刺入约0.5～0.8cm（视鸡只大小），刺入静脉窦后，针头感觉无阻力，抽取血液，术毕消毒。注意：此法采血后，亦会引起鸡只死亡，故适用于淘汰鸡的采血。苗鸡采血亦可用此法。一、畜禽血液采集技术（23）（五）羊静脉血样的采集

1、颈静脉采血器械准备：酒精或碘酊棉球；小试管，试管架；镊子；配7＃长针尖的一次性注射器。保定：站立保定。保定需2人。一人立于羊的左侧前方，左手托住羊的下颔，右手抱住羊的耳根部，使头上扬并贴住术者身体。另一人产于羊的后方，用两手稳住羊的臀部，避免左右走动。一、畜禽血液采集技术（24）部位确定：同牛。一般在羊右侧颈中上部。操作：术者蹲于羊的右侧，左手大拇指按压颈下部颈静脉的近心端片刻，使颈静脉怒张，剪毛，酒精消毒后，以碘酊标记部位。右手持针，针头与颈静脉成30～45°角，顺静脉方向刺入，抽取血液。术毕，消毒按压止血。一、畜禽血液采集技术（25）2、前腔静脉采血方法基本与猪前腔静脉采血同。此法适用于羔羊。二、畜禽病料采集技术（1）

（一）样品采集的原则：采集检测样品是诊断检测工作的重要内容。采样的时机是否适宜，样品是否具有代表性，样品处理、保存、运送是否合适及时，与检验结果的准确性、可靠性关系极大。采集样品时，需要符合以下规定：

二、畜禽病料采集技术（2）适时采样。根据检测要求及检测对象和检验项目的不同，选择适当的采样时机十分重要。样品是有时间要求的，应严格按规定时间采样，有临床症状需要作病原分离的，样品必须在病初的发热期或症状典型时采样，病死的动物，应立即采样。二、畜禽病料采集技术（3）合理采样。根据诊断检测的要求，须严格按照规定采集各种足够数量的样品外，不同疫病的需检样品各异，应按可能的疫病侧重采样。对未能确定为何种疫病的，应全面采样。典型采样。选取未经药物治疗、症状最典型或病变最明显的样品，如有并发症，还应兼顾采样。二、畜禽病料采集技术（4）无菌采样。采集检验样品除供病理组织学检验外还供病原学及血清学检验，供病原学及血清学检验的样品，必须无菌操作采样，采样用具、容器均须无菌处理，尸体剖检需采集样品的，先采样后检查，以免人为污染样品。适量采样。采集样品的数量要满足诊断检测的需要，并留有余地，以备必要时复检使用。二、畜禽病料采集技术（5）样品处理。采集的样品应一种样品一个容器，立即密封，根据样品的性状检验要求的不同，作暂时的冷藏、冷冻或其它处理。供病毒学检验的样品，数小时内要送到实验室，只作冷藏处理，超过数小时的要冷冻处理，（冻结方法：可将样品放入-30℃冰箱内冻结，然后再装入有大小冰块或干冰的冷藏瓶（箱）内运送，亦可将装入样品的容器放入隔热二、畜禽病料采集技术（6）保温瓶内，再放入冰块，然后按100ｇ冰块加入食盐约35克，立即将隔热保温瓶瓶口塞紧。瓶内温度可达-21℃左右）。供细菌学检验或血清学检验的样品，冷藏送实验室即可。装样品的容器应贴上标签，标签要防止因冻结而脱落，标签标明采集的时间、地点、号码和样品名称，并附上发病、死亡等相关资料，尽快送实验室。二、畜禽病料采集技术（7）安全采样。既要保护采样人员，以要防止病原外泄，还要防止样品受到污染。8、样品包装。主要是密闭，防止样品损坏、污染和外泄等意外发生。9、迅速送检。应尽快送实验室进行检测，延误送检时间，会影响到检测质量和结果的可靠性。二、畜禽病料采集技术（8）（二）血液样品的采集

1、病毒检验用血液样品。应在动物发病初体温升高期采集。血液样品必须是脱纤血或是抗凝血。抗凝剂可选用肝素或EDTA，枸缘酸钠对病毒有轻微毒性，一般不宜采用。采血前，在真空采血管或其它容器内按每毫升血液加入0.1%肝素1ml或EDTA20mg。采集的血液立即与抗凝剂充分混合，防止凝固。采脱纤血时，先在容器内加入适二、畜禽病料采集技术（9）量小玻璃珠，加入血液后，反复振荡，以便脱去血液纤维。采集的血液经密封后贴上标签，以冷藏状态立即送实验室。必要时，可在血液中按每毫升加入青霉素和链霉素各500～1000IU，以抑制血源性可采血中污染的细菌。二、畜禽病料采集技术（10）2、细菌检验样品。采血应在动物发病初体温升高或发病期，未经药物治疗期间采集。血液应脱纤或加肝素抗凝剂(或EDTA或枸缘酸钠)，但不可加入抗生素。采集的血液经密封后贴上标签，以冷藏状态立即送实验室，否则须置4℃冰箱内暂时保存，但时间不宜过久，以免溶血。二、畜禽病料采集技术（11）3、血清学检验样品。用作血清学检验的样品不加抗凝剂或脱纤处理。为保障血清质量，一般情况下，空腹采血较好。采集的血液贴上标签，室温静置待凝固后送实验室，并尽快将自然析出的血清或经离心分离出的血清吸出，按需要分装，再贴上标签冷藏保存备检。较长时间才检验的，应冻结保存，但不能反复冻融，否则抗体效价下降。作血清学检验的血液，在采血、运送、分离血清过程中，应避免溶血，以免影响检验结果。采集双份血清检二、畜禽病料采集技术（12）测比较抗体效价变化的，第一份血清采于发病的初期并作冻结保存，第二份血清采于第一份血清后3～4周，双份血清同时送实验室。4、寄生虫检验样品。因不同的血液寄生虫在血液中出现的时机及部位各不相同，因此需要根据各种血液寄生虫病的特点，取相应时机及部位的血液制成血涂片，送实验室。二、畜禽病料采集技术（13）（三）组织样品的采集组织样品一般由扑杀动物或病死尸体剖中采集。从尸体采样时，先剥去动物胸腹部皮肤，以无菌器械将腹腔打开，根据检验目的和生前疫病的初步诊断，无菌采集不同的组织。二、畜禽病料采集技术（14）1、病毒检验样品。作病毒检验的组织，必须以无菌技术采集，组织应分别放入灭菌的容器内并立即密封，贴上标签，放入冷藏容器立即送实验室。如果时间较长，可作冻结状态运送，也可将组织块浸泡在PH7.4左右的乳汉液或磷酸缓冲肉汤保护液内，并按每毫升保护液加入青霉素、链霉素各1000IU，然后放入冷藏容器内送实验室。二、畜禽病料采集技术（15）2、细菌检验样品。供细菌检验的组织样品，应新鲜并以无菌技术采集。如遇尸体已经腐败，某些疫病的致病菌仍可采集于长骨或肋骨，从骨髓中分离细菌。采集的所有组织分别放入灭菌的容器内并立即密封，贴上标签，放入冷藏容器立即送实验室。二、畜禽病料采集技术（16）（四）粪便样品的采集

1、病毒检验样品。分离病毒的粪便必须新鲜。少量采集时，以灭菌的棉拭子从直肠深处或泄殖腔粘膜上蘸取粪便，并立即投入灭菌的试管内密封，或在试管内加入少量PH7.4的保护液再密封。贴上标签冷藏送实验室。2、细菌检验样品。作细菌检验的粪便，最好在动物使用抗菌药物之前，从直肠或泄殖腔粘膜上采集二、畜禽病料采集技术（17）采样方法与供病毒检验的相同。可投入无菌缓冲盐水或肉汤的指形管内，贴上标签冷藏送实验室。3、寄生虫检验样品。粪便样品应选取新排出的或直接从直肠内采得，以保持虫体或虫体节片及虫卵的固有形态，一般寄生虫检验的粪便用量较多。采得的粪便以冷藏不冻结状态送实验室。

二、畜禽病料采集技术（18）（三）几种畜禽疫病的样品采集1、口蹄疫样品的采集、保存和运送口蹄疫病毒在病畜的水疱皮内及其淋巴液中含毒量最高。在水疱发展过程中，病毒进入血流，分布到全身各种组织和体液。在发热期血液内的病毒含量最高，退热后在奶、尿、口涎、泪、粪便等都含有一定量的病毒。二、畜禽病料采集技术（19）（1）组织样品样品的选择。用于病毒分离、鉴定的样品以发病动物(牛、羊或猪)未破裂的水泡皮和水泡液为最好。对临床健康但怀疑带毒的动物可在扑杀后采集淋巴结、脊髓、肌肉等组织样品作为检测材料。二、畜禽病料采集技术（20）样品的采集和保存.样品采集部位可用清水清洗(切忌使用酒精、碘酒等消毒剂消毒、擦拭)，剪取病畜的新鲜水泡皮3～5克放入灭菌小瓶中，加适量50％甘油／磷酸盐缓冲液(pH7.4)，加盖密封；也可采用无菌器具采集水泡液至少1毫升，装入灭菌小瓶中(可加适量抗菌素)，加盖密封。尽快冷冻保存。二、畜禽病料采集技术（21）在无法采集水泡皮和水泡液时，可采集淋巴结、脊髓、肌肉等组织样品3～5克装入洁净小瓶内，加盖密封尽快冷冻保存。样品的包装瓶上均要贴上标签，写明采样地点，动物种类，编号，时间等。二、畜禽病料采集技术（22）（2）牛、羊食道—咽部分泌物(O—P液)样品

样品采集。被检动物在采样前禁食(可饮水)12小时，以免胃内容物反流污染O—P液。采样探杯在使用前经0．2％柠檬酸或2％氢氧化钠浸泡5分钟，再用洁净水冲洗。每采完一头动物，探杯要重复进行消毒并充分清洗。采样时动物站立保定，将探杯随吞咽动作送入食道上部10～15cm处，轻轻来回移动2～3次，然后将探杯拉出。二、畜禽病料采集技术（23）样品的保存将采集到的8～10mLO—P液倒入25mL以上的灭菌玻璃容器中，容器中应事先加有8～10mL细胞培养液或磷酸缓冲液(0.04mol／L、pH7．4)，密封后充分摇匀后尽快冷冻保存，用于病原检测，做出追溯性诊断。二、畜禽病料采集技术（24）血清怀疑曾有疫情发生的畜群，错过组织样品采集时机时，可无菌操作采集动物血液，每头不少于10mL。无菌分离血清装入灭菌小瓶中，加盖密封后冷藏保存，通过检测抗体，做出追溯性诊断。采集样品时要填写样品采集登记表(见附表4)。二、畜禽病料采集技术（25）装样玻璃容器必须密封，即防水又不透气。样品容器需加贴防水标签，并写明样品编号、采集地点、动物种类、时间等。样品运送。运输前将样品玻璃容器装入金属套筒中，套筒应填充防震材料，加盖密封，与采样记录一同装入专用运输容器中。专用运输容器应隔热坚固，内装适当冷冻剂和防震材料。外包装上要加贴生物安全警示标志。二、畜禽病料采集技术（26）禽流感的样品采集、保存和运输

病毒主要在呼吸道粘膜细胞内增殖。病禽至少从5只濒死禽采集样品。样品包括：泄殖腔拭子和气管拭子(置于缓冲液中)各5个(小珍禽可采集新鲜粪便)；气管和肺的混样二、畜禽病料采集技术（27）5个，肠管及内容物的混样5个；肝、脾、肾和脑等组织样品(不能混样)各5个。采集方法：1)泄殖腔棉拭子：将棉拭子插入肛门并旋转，使粪便沾在拭子上，后放在运输缓冲液中。2)气管棉拭子：活鸡采样时，将棉拭子插入活鸡的气管内，轻轻擦拭气管壁并放入缓冲液中。死亡动物采气管样品二、畜禽病料采集技术（28）时，可在肺和气管离体情况下进行采集，应将棉拭子插入较深部位用力擦拭，并按上述方法将棉拭子放在运输缓冲液中。3)粪便样品：可从活禽市场采取新鲜粪便，用棉拭子沾取粪便，并将采好的样品放在运输缓冲液中。二、畜禽病料采集技术（29）分别采集至少10个病鸡的血样