动物细胞融合

医学细胞生物学设计型实验

实验项目:动物细胞融合

小组成员：覃科（1310750171）张天毅（1310750175）袁建侠（1310750179）吴金宝（1310750180）目录1、实验目的2、实验原理3、实验步聚4、实验预期结果5、融合过程观察以及融合率的计算6、实验试剂及材料7、注意事项一、实验目的1、了解PEG诱导鸡血细胞融合的原理2、初步掌握细胞融合技术及融合率的计算方法。动物细胞融合细胞融合又称细胞杂交，是两个或多个细胞合并形成一个双核或多核细胞的过程。用人工方法诱导细胞融合是20世纪60年代发展起来的新兴技术，发展速度非常快，应用范围极为广泛，已成为广泛，已成为研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤及生物新品种培育的重要手段。二、实验原理人工合成形成的融合细胞有两类：

由不同亲本细胞融合而来由同一亲本细胞融合而来异核体同核体3、诱导方式物理法：化学法：生物法：灭活的病毒电激、振动、离心聚乙二醇（PEG）例如：仙台病毒目前应用最广泛的是PEG，因为PEG易得、简便，且融合性效果好。PEG可借氢键与H2O结合，高浓度的PEG溶液易使细胞脱水而发生质膜结构变化，导致细胞融合。灭活的病毒颗粒黏附于细胞表面细胞膜被病毒颗粒穿通细胞膜连接细胞融合，形成杂种细胞（细胞膜具有一定的流动性）4.生物法：灭活的病毒（丧失感染性、保留抗原结构）过程：细胞融合的应用搞科研三、实验步骤（一）、50%PEG液的制备根据实验需要，称取一定量的PEG（MV=4000）放入刻度离心管内，用试管夹夹住，在酒精灯焰上加热，使其溶化，冷却至50~60°C时，加入预热的等体积Hanks液混匀，置之37℃水浴箱中保温待用。实验操作流程（一）50%PEG液的制备取一定量PEG放入刻度离心管内在酒精灯火焰上加热使其溶化待降至50~60°C时加入预热的等体积Hanks液混匀置于37℃水浴箱中保温待用（二）、融合方法：10%鸡血细胞的制备

1、用肝素钠处理后的注射器，在公鸡翼下抽取2ml静脉血，加入盛有8mlAlsever液的试管中，使血液：Alsever液的比例为1:4，混均后可在冰箱中存放一周。2、取鸡血细胞悬液1ml到10ml离心管，加入9ml

0.85%生理盐水混匀，1000r/min离心5min，弃上清液，再按照上述条件离心洗涤2次。3、收集沉淀细胞，加入8ml~10mlHanks液配置成10%的鸡血细胞悬液。取10%的鸡血细胞悬液1ml加入离心管中加入8—10mlHanks液倾去上清液，将离心管倒置于滤纸上取50%PEG

0.5ml加入5mlHanks液混匀放入离心机中

1000r/min离心5min倾去上清液再次悬浮细胞离心洗涤一次手指轻弹离心管在37℃水浴中于1min内逐滴入离心管加入9mlHanks在37℃水浴中静置5min稀释PEG齐去上清液在37℃水浴中温浴20~30min加2-3mlHanks液在5min10min20min30min去悬液制片用0.2%亚甲基蓝染色观察四、预期结果：

（一）融合过程观察：分别于温育5min、10min、15min、20min、30min取细胞悬液一滴制成临时装片，以0.2%次甲基蓝染液染色，在显微镜下观察细胞融合的不同阶段，通常可把融合过程大致分为5个阶段：细胞融合过程图五个阶段两个细胞的膜相互接触，粘连。相接的两细胞膜破口粘合形成细胞膜通道。两细胞之间细胞质相遇，形成细胞质通道。通道扩大，两细胞连成一体。细胞合并完成，形成一个含有两个或多个核的圆形细胞。

（注：上述阶段可在不同时期观察）五、融合率的计算：

融合率是指在显微镜视野内，已发生融合的细胞，其细胞核的总数与视野内所有细胞（包括已融合和未融合细胞）的细胞核总数之比。对孵育30min时制备的临时装片计算融合率。通常以百分数表示，进行多个视野测定值的平均统计更加准确。

融合率=（融合的细胞核数/总细胞核数）×100%六、实验试剂及材料1、材料：成年健康公鸡。2、试剂：聚乙二醇（PEG，Mr=4000）、0.2%亚甲基蓝染液、Alsever液、0.85%生理盐水、Hanks液。3、仪器设备：显微镜、恒温水浴箱、离心机、电子天平、刻度离心管、试管、试管架、酒精灯、量筒、吸管、载玻片、盖玻片、注射器、烧杯。七、注意事项：

1、1.在离心管中加PEG之前，一定要将离心管倒置滤纸上，流尽