人类EGFR 基因突变检测

人类EGFR基因突变检测试剂盒（荧光PCR法）操作规范【产品名称】通用名：人类EGFR基因突变检测试剂盒（荧光PCR法）英文名：DiagnostickitforMutationsofHumanEGFRGene（FluorescencePCRAnalysis）【包装规格】20测试/盒【预期用途】表皮生长因子受体（EGFR）属于I型酪氨酸激酶受体，定位于细胞膜上。EGFR被表皮生长因子（EGF）等配体激活后，将信号传导至胞内，调控细胞的生长、增殖、转化等生理过程。EGFR位于染色体7pll.2，由原癌基因C-erbB-1编码，包含28个外显子，其中外显子18〜24编码受体酪氨酸激酶功能区。研究表明该区域内发生基因突变与吉非替尼等靶向药物的反应性相关。这类药物的作用机制主要是通过抑制EGFR胞内磷酸化而阻滞传导，抑制肿瘤细胞的增殖，实现靶向治疗。EGFR基因突变主要是19外显子的缺失突变和21外显子的L858R点突变，占突变总数的90%以上。19外显子的缺失突变集中于746-753位密码子，其中2种E746_A750del（2235_2249del15和2236_2250del15）最常见。19，21外显子的这些突变造成EGFR胞内酪氨酸激酶功能区的结构改变，提高EGFR与靶向药物的结合能力，使靶向药物疗效更好。据中国2010版《肿瘤学临床实践指南》数据，亚洲人非小细胞癌EGFR突变率高达30~40%,回顾性研究报道显示，使用厄洛替尼或吉非替尼后肿瘤缓解的非小细胞肺癌患者大约90%携带突变，而未缓解者则无突变。本试剂盒以人非小细胞肺癌、结直肠癌肿瘤组织切片提取的基因组DNA为检测样本，用于EGFR基因19、21外显子多种突变的定性检测，因此本试剂盒检测结果仅用于辅助临床医生对非小细胞肺癌、结直肠癌肿瘤患者制定用药方案。【检验原理】本试剂盒基于实时荧光PCR平台，结合等位基因特异性扩增（ARMS）技术、野生型基因扩增抑制技术和多重PCR技术检测EGFR基因19、21外显子的14种突变（表1）。ARMS技术是指PCR引物的3'端末位碱基必须与其模板DNA互补才能有效扩增，通过设计特异性ARMS引物组（共6条ARMS上游引物，包括5条检测19外显子突变和1条检测21外显子突变的引物）和2条下游引物，对存在突变的EGFR基因19、21外显子的靶序列进行多重PCR扩增，并利用分别标记有HEX荧光基团——BHQ1淬灭基团和FAM荧光基团——BHQ1淬灭基团的两条Taqman探针分别实现对19,21突变外显子扩增产物进行检测。因为人类EGFR基因突变检测试剂盒（荧光PCR法）说明书采用了野生型基因扩增抑制剂，使ARMS体系能够耐受更高浓度的背景野生型EGFR基因，降低了试剂盒对基因组样本的DNA浓度要求，提高了检测灵敏度。为质控扩增体系的有效性，试剂盒设置了内质控和外质控，内质控基因是人类基因组的一个保守片段，长度与EGFR目标片段相似，均为100bp左右，内控探针采用标记ROX荧光基团——BHQ2淬灭基团的Taqman探针对内控基因扩增产物进行检测。内控引物、探针及内控基因对ARMS体系的扩增效率无影响。阳性对照品是一种扩增效率最低的EGFR基因19外显子L747_P753>S突变质粒与野生型人类基因组DNA的混合物，用于PCR扩增的外质控。本试剂盒包含PCR反应液I、PCR反应液II和对照品等3管试剂。PCR反应液I包含外显子19突变扩增用5+1条引物对和1条探针（HEX标记），浓度20~100pM，19外显子野生型基因扩增抑制剂，浓度1200pM；外显子21L858R突变扩增用1对引物、1条探针（FAM标记），浓度20~100pM，和21外显子野生型基因扩增抑制剂，浓度800pM；内控基因扩增用1对引物和1条探针（ROX标记），浓度20~100pM。PCR反应液II包含0.1U/口lTaq酶和50nMdNTP、750nMMg2+等。阳性对照品包含21外显子L858R突变质粒（300copies/口1）、19外显子L747_P753>S突变质粒（300copies/口1）和10ng/口1野生型人类基因组DNA（3000copies/口1）。检测必须但试剂盒中不包含的组分：1.5ml离心管（用于配制PCR反应液和DNA提取）；0.2mlPCR管或8联PCR管或96孔PCR板；带滤塞的吸头（1ml、200U1和10口1）；DNA提取试剂盒ReliaPrep™FFPEgDNAMiniprepSystem（货号：A2352）【贮存条件及有效期】置于-20°C条件下储存，有效期6个月。4-10°C避光条件下储存或运输不得超过7天。【适用仪器】适用于ABI7500、LinegeneFQD-96型号的Real-timePCR扩增仪。【样本要求】适用样本为非小细胞肺癌、结直肠癌石蜡包埋病理组织切片，切片厚度10um，数量1片，所用切片样品保存不超过3年。由于肿瘤的复杂性，所采集的临床样品往往会混有正常组织细胞，石蜡包埋病理切片样品肿瘤病变细胞应不低于10%，所取部分应尽量在蜡块中部；使用商业化的试剂盒来提取人类基因组DNA，推荐使用Promega公司的ReliaPrep™FFPEgDNAMiniprepSystem（A2352）提取石蜡包埋组织切片样品，所提DNA需用紫外分光光度计测定浓度和纯度，其DNA0D260/0D280的值应在1.8~2.0，浓度应在3~300ng/口1之间，样本DNA质量不合格者不得用于检测，建议重新取切片进行核酸提取，提取完的DNA建议立即进行检测，否则请于-20C以下保存，保存时间不要超过6个月。【检验方法】一、核酸提取（样本处理室）使用ReliaPrep™FFPEgDNAMiniprepSystem进行核酸提取，提取步骤如下。用矿物油去除石蜡加矿物油500^1到装有组织切片样本的1.5ml离心管内，80°C孵育lmin,振荡混匀；组织样本裂解，消化组织蛋白质1） 离心管内加入200U1裂解液，室温10,000g离心15s，形成水油两相溶液，下层为水相，上层为油相；2） 向离心管水相加入20口1蛋白酶K,用移液枪吸打混匀；3） 56C孵育1h；4） 80C孵育1h；5） 冷却到室温，离心15s；去除RNA向离心管水相加入10口1RNaseA,吸打混匀。室温（20-25C）孵育5min；用核酸提取柱提取基因组DNA1） 加入220口1BLBuffer到含裂解样品的离心管中，再加入240^1乙醇（95-100%）,震荡混匀，室温10,000g离心15s,形成水油两相溶液，下层为水相，上层为油相；2） 将结合柱置于收集管内，小心吸取离心管下层水相（包括可能形成的沉淀）转移到结合柱内，盖上管盖，将离心管丢弃。3） 收集管室温10,000g离心30s，弃去管中的滤出液。4） 把柱子重新装入收集管中，加入500U11 洗涤液至柱内，室温10,000g离心30s,弃去滤出的洗涤液。5） 重复步骤4）再洗涤一次；6） 打开结合柱盖子，室温条件下16,000g离心3min以甩干柱内残余的液体；7） 把柱子转移至一个干净的自备 1.5m1离心管中，向柱内加入50口1E1utionBuffer，室温16,000g离心1min洗脱基因组DNA，丢弃提取柱。\I■■ \ 『—r-*-.注意事项：操作提取柱和收集管时应戴好一次性手套；收集基因组DNA前的16,000g离心3min操作必须开盖，以除净乙醇，乙醇残留过量将严重影响基因组的收集质量。二、 试剂准备（试剂准备室）将试剂从冰箱取出，室温融化，混匀，lOOOrpm快速离心20秒，备用；三、 反应体系配制（试剂准备室）根据检测样本数计算所需反应数，如样本数为n则需做n+2个反应（包含一个阳性对照和一个无模板对照反应）；根据表3计算所需各反应液的体积，并配制反应体系，反应体系混匀后3000rpm快速离心30秒，分装至PCR管中，每管18口1；表3加样表组分1反应3）N个反应（pl）PCR反应液I14PCR反冋液1[44XN总体积181SXN四、 加样（样本处理室）取2口1提取的样品DNA加入PCR反应管，盖上管盖，1000rpm离心或轻甩，排除管底气泡；阳性对照反应所用模板为试剂盒中对照品，空白对照反应所用模板为超纯水（自备）。五、 上机检测（扩增室）将PCR管按顺序放入PCR仪，按表4设置反应程序；表4反应理序阶段温度时间检测荧光循环数95TC2mm循环段15sec1052X?SQscc72r15sec循环囱2931C3sec3556TC30&ecJ60L130sec注：在循环段2的56°C时检测FAM、HEX、ROX三个通道的荧光。运行PCR反应程序，保存文件。六、 结果获取荧光定量PCR仪运行结束后，使用配套软件对本次试验的结果进行分析。【参考临界值】以扩增过程前3-15循环的荧光值的10倍标准差为阈值，以荧光值超过阈值的循环数为阈值循环数（Ct值）。【检验结果的解释】空白对照应在FAM、HEX和ROX通道均无Ct值或无典型的S型扩增曲线升起；若空白对照管在至少一个通道有典型的S型扩增曲线升起，可能为试剂受到污染或操作过程中的污染，请排除污染源后重新检测；阳性对照应在FAM、HEX和ROX通道均有典型的S型扩增曲线升起，且Ct值12〜25间;若对照品有至少一个通道无典型的S型扩增曲线升起或Ct值<12或Ct值±25，该批次样本需重新检测，请确认所使用的试剂是否仍在有效期内，确定操作是否严格按照说明书进行;若满足1和2要求，表明此次实验成功，对样品管进行分析：（1）内控（ROX通道）应有典型的S型扩增曲线升起，且Ct值10~22之间，表明所加样本DNA质量正常；若Ct值<10，表明所加样本过量，请将样本稀释后再次检测;若Ct±22或无扩增，表明所加样本DNA含有PCR抑制剂或DNA量不够，可能影响低突变率样本的检测结果，请重新提取DNA后检测;（2） 样本突变信号（FAM通道）有典型的S型扩增曲线升起，且Ct值W32，则判定该样本EGFR基因21外显子L858R突变阳性；（3） 样本突变信号（FAM通道）无典型的S型扩增曲线升起，或Ct值大于32，则判定该样本EGFR基因21外显子L858R突变阴性；（4） 样本突变信号（HEX通道）有典型的S型扩增曲线升起，且Ct值W32，则判定该样本EGFR基因19外显子缺失突变阳性；（5） 样本突变信号（HEX通道）有典型的S型扩增曲线升起，或Ct值大于32，则判定该样本EGFR基因19外显子缺失突变阴性。【检验方法的局限性】本试剂盒仅适用于规定的仪器和检测系统，检测结果仅供临床参考，不得作为临床诊治的唯一依据。本试剂盒尚无临床实验数据证实EGFR基因突变与靶向药物用药的相关性，其相关性主要来自文献报道。【产品性能指标】经1050例非小细胞肺癌和结直肠癌肿瘤组织样本临床试验，本品与测序法作对照，阳性符合率为99.0%，阴性符合率为96.6%，总符合率为97.5%。试剂盒应外观清洁、无泄漏、无破损，标志、标签字迹清楚；各组分融化后应澄清透明，无色，无沉淀。检测20份阳性参考品，阳性参考品符合率应为100%。检测10份阴性参考品，阴性参考品符合率应为100%。可以检出10ng野生型基因组DNA背景下，含量低至1%的EGFR基因的14种突变。用4份企业内部精密性参考品分别作10次平行检测，结果均为阳性且Ct值变异系数CVW5%。【注意事项】本试剂盒仅用于体外研究。实验前请仔细阅读说明书。PCR检测应在有资质的临床PCR实验室进行，实验室应严格按照卫生部《医疗机构临床基因扩增检验实验室管理办法》卫办医政发〔2010〕194号文件