梅毒螺旋体的实验室常见的诊断方法综述,性医学论文

梅毒螺旋体的实验室常见的诊断方法综述,性医学论文梅毒危害极大,在我们国家曾一度被消灭,但随着近年来对外沟通的日益频繁又死灰复燃,发病率呈逐年上升趋势。2020年国家卫生部颁布的甲、乙类法定报告传染病中,梅毒发病率较2018年上升3.27%,死亡率上升5.36%,应引起重视。因而早期检出患者,及时治疗,控制传染源,是控制梅毒传播的重要措施。梅毒检测方式方法有多种,现就梅毒螺旋体的实验室常见的诊断方式方法作一扼要综述。1、病原体的检测对患者分泌物进行观测,如发现运动的苍白螺旋体即可确诊为梅毒,该方式方法特异性高,但灵敏度稍低,容易漏检。梅毒检测适用于早期梅毒皮肤黏膜损害,对硬下疳尤为重要,由于人体感染TP3~6周后,才能通过梅毒螺旋体抗原血清试验(TPHA)、梅毒荧光抗体(FTA)等敏感性、特异性较高的方式方法检测到血清中的抗体,在患者血清抗体到达可测水平之前,TP检查是早期诊断梅毒最好的方式方法。1.1暗视野显微镜(DF)检查梅毒螺旋体暗视野检查法是梅毒病原体检测的主要方式方法。在皮损处,用玻片刮取组织渗出液或淋逢迎穿刺液,用500暗视野显微镜观察,在暗背景上,梅毒螺旋体呈白色发光、运动快速、急促,可以较缓慢地围绕长轴旋转。根据其典型的形态、大小和运动方式,结合临床异常感觉和状态可直接诊断梅毒。暗视野检查法特异性高,适用于早期梅毒的诊断。但由于受病程、取材、检测人员技术水平以及部分患者不规则使用抗生素导致TP数量减少和活动力下降的影响,敏感性较低为54.4%,因而此法检查阴性也不能排除患梅毒的可能。该法简单、快速,但不适用于潜伏及晚期梅毒患者。且口腔中可能存在其他螺旋体,因而此法对口腔病灶材料亦不适用。1.2活体组织检查梅毒螺旋体常用银染色法(war-thin-starry)或直接荧光抗体试验(DFAT)检查活体组织梅毒螺旋体。银染色法能使梅毒螺旋体染成棕褐色或黑褐色,形态清楚明晰易辩,且标本能够永久保存。但由于存在梅毒螺旋体类似物质的干扰,因而,银染色阳性结果的判定应慎重。特异性荧光抗体试验是用非致病性螺旋体培养物对抗梅毒螺旋体抗血清或单克隆抗体吸收后,再与异硫氰酸荧光素(FITC)相结合,在荧光显微镜下判读结果。梅毒螺旋体发特异性黄绿色荧光,灵敏性稍高于暗视野检查法。可用于梅毒螺旋体与类似螺旋体的鉴别。1.3多功能超高倍显微诊断仪(MDI)是一种集光学、光电学、电子学、医学影像学和多媒体计算机技术于一体的高科技医学显微设备,其具有共轭变焦、高清楚明晰度、高分辨率、高放大倍率的特点,有效放大倍率可达20000倍以上。能够快速、便捷的进行标本观测。其在Ⅰ期梅毒诊断的阳性率为83.75%,但由于设备昂贵难以普及。2、梅毒血清学检查机体感染梅毒螺旋体后可产生两种抗体,一种是抗梅毒螺旋体的特异性抗体(IgM和IgG);一种是非梅毒螺旋体特异性的抗体,即反响素。梅毒血清学检查包括非梅毒螺旋体抗体检测(非特异性抗体检测)和特异性梅毒螺旋体抗体检测。前者敏感性、特异性均较后者低,但由于抽血后1h即可出结果,费用也低廉,因而常用于临床挑选。并且非特异性抗体在治疗后下降或消失,因而可断定治疗效果。后者敏感性和特异性均较高,主要用于确认试验,但由于其不随治疗下降或消失,故不能用于断定治疗效果。2.1非梅毒螺旋体血清试验非梅毒螺旋体血清试验检测的为非特异性抗体(反响素),某些其他疾病患者如结核、红斑狼疮、类风湿性关节炎、猩红热等甚至健康人中可以出现反响素,因而可出现生物学假阳性。除此之外,标本溶血或容器污染等亦可引起假阳性反响,其特异性较低。经治疗后患者反响素可消失或阴转,通常用于疗效观察、判定复发及再感染。2.1.1性病研究实验室试验(VDRL):以心磷脂、胆固醇及卵磷脂的混悬液作为抗原,与机体产生的反响素在体外发生反响。属于微量玻片法,操作简单、快速,对诊断神经梅毒有重要价值,敏感性可达99%,特异性达70.8%。可作定量及定性试验,但对一期梅毒敏感性低。2.1.2快速血浆反响素环状卡片试验(RPR):VDRL试验的改进。用标准活性炭颗粒吸附VDRL抗原,操作简单、快速,结果易于观察,灵敏度较VDRL高,是当前临床应用最多的检测方式方法之一。RPR可检测滴度,滴度可在治疗后半年到2年下降4倍,滴度变化是观察治疗效果、复发或再感染的重要指标。RPR试验和DF方式方法相结合,可早期诊断梅毒。其缺点是反响素水平过高可产生假阴性结果。该法对神经梅毒、潜伏期梅毒不敏感。2.1.3不加热血清反响素玻片试验(USR):为改进的VDRL试验,待检血清不需加热灭活,直接在玻片上进行絮状反响,肉眼判读结果。此法敏感性高而特异性较低,易发生生物学假阳性,亦可作为疗效观察、判定复发或再感染的指标。2.1.4甲苯胺红不加热血清实验(TRUST):其原理是以甲胺苯红染料颗粒代替炭颗粒作为指示物,当液体中出现凝集程度不同的红色凝块时即判为阳性,简便快速,结果判读以白色纸卡为背景,清楚明晰易判,稳定性好。对于非梅毒螺旋体特异性抗体的检测,TRUST法的检出率和重复性均优于RPR法。但由于在梅毒感染的早期和潜伏期,血清中反响素很少,其检出率亦较低,分别为72.7%和73.7%。2.2梅毒螺旋体血清试验此类试验采用的抗原是梅毒螺旋体或其成分,检测血清中的抗梅毒螺旋体IgM和/或IgG抗体,其敏感性和特异性均较高,一般用作确证试验。但由于特异性IgG抗体可终身存在,因而不能用作疗效观察。2.2.1梅毒螺旋体血球凝集试验(TPHA):该法使用甲醛处理的羊红细胞做抗原载体,吸附从兔睾丸中提取后经超声波粉碎的Nichols株梅毒螺旋体菌体抗原,检测血清中抗梅毒螺旋体特异性抗体。为排除非特异性反响,待测血清需经吸收剂(兔睾丸提取物、正常兔血清及超声处理的密螺旋体无毒株Reiter株)吸收,因而TPHA具有高度的敏感性和特异性,是当前临床常用的梅毒血清学确证试验。其缺点是抗原制备困难,试剂较昂贵,操作较繁琐,且易发生自凝现象。2.2.2梅毒螺旋体明胶凝集试验(TPPA):TPPA与TPHA不同的是用明胶颗粒代替羊红细胞做抗原载体,吸附梅毒螺旋体Nichols株菌体抗原,进而避免了TPHA法血球易自凝而造成的漏诊。TPPA敏感度和特异性均较高,分别为99.2%和97.0%,在临床上亦常用于梅毒血清学确证试验。该法操作简便、快速,结果易于判定,但同样由于试剂价格较昂贵而使其在临床的大规模使用遭到限制。2.2.3荧光密螺旋体抗体吸收试验(FTA-ABS):是一种间接荧光抗体法,其先以密螺旋体无毒株(Reiter株)超声裂解抗原吸收待检血清,除去具有穿插反响的抗体,再与梅毒螺旋体菌体作用,然后参加荧光素标记的抗人IgG。此法敏感性、特异性均较高,文献报道FTA-ABS对各期梅毒检测的特异性到达92%,对一期梅毒敏感性为80%,二期为99%~100%,三期为95%~100%,亦常被用做确证试验。FTA-ABS-19S-IgM试验是先将血清中IgG和IgM分离,再用FTA-ABS法检测19S-IgM抗体,避免了母体IgG的干扰,常用于新生儿先天梅毒血清学的诊断试验,是早期确诊先天梅毒的重要手段。其缺点在于步骤繁琐,操作费时,结果判读易受操作人员经历体验的影响。2.2.4快速乳胶凝集试验(syphilisfasttest):本试验是将梅毒螺旋体TpN15、TpN17与TpN47重组抗原结合到乳胶颗粒上,当血清中存在特异性梅毒螺旋体抗体时,即可发生凝集反响。其与TPPA一致率可达98.8%,有一定的敏感性和特异性。该试验操作简单、快速,合适门诊梅毒检测。2.2.5梅毒螺旋体免疫印迹技术(WB):该法将免疫学的特异性和分子生物学的灵敏性相结合,具有敏感性高、特异性强的特点。Byrne等用免疫印迹法检测梅毒螺旋体抗体时,以为只要当15.5、17、44.5、47kDa4个抗原中的3个被检测到才能判定为阳性,其敏感性为98%,特异性为100%。诊断梅毒的灵敏性优于FTA-ABS约3~4个血清稀释度。对神经性梅毒检测的阳性率为100%。此法操作简便,特异性好,结果易判,但成本较高。2.2.6梅毒螺旋体酶联免疫吸附试验(TP-ELISA):是将梅毒螺旋体TpN15、TpN17与TpN47重组抗原包被在微孔板上,采用双抗原夹心法检测梅毒螺旋体特异性抗体。其原理是利用包被的梅毒特异性抗原对血清中的抗体进行初筛,然后通过酶标记的特异性抗原再次进行挑选,因而增加了结果的特异性。该法可同时检测IgM、IgG抗体,缩短了窗口期,提早了对感染后的检出,十分是TP-IgM对早期梅毒、先天梅毒的诊断有重要意义。文献报道TP-ELISA方式方法的敏感性高于荧光密螺旋体抗体吸收试验(FTA-ABS),对一期梅毒的诊断灵敏度为93.8%,且生物学假阳性和假阴性发生率明显低于RPR。该方式方法操作简单,易于自动化,合适大批量样本检测,结果准确可靠,被公以为梅毒血清学诊断试验的首选方式方法。2.2.7梅毒胶体金法(ICS):金标法是一种快速体外诊断技术。应用基因重组技术制备梅毒螺旋体特异性基因工程抗原,采用胶体金标记和免疫层析技术,能够高度特异的检测待测血清中的抗体。可用于全血、血浆、血清的检测,灵敏度高,可用于梅毒的快速检测和相关筛查。胶体金法检测TP-IgM还可用于诊断梅毒复发和再感染的检测。2.2.8化学发光法(CMIA):将TP抗原包被到固体铁粒子上,使其与标本中的抗TP抗体反响,再与酶标抗人IgG抗体结合,构成抗原-抗体复合物后,参加化学发光基质,根据化学发光基质的发光量可计算出标本中抗TP抗体的含量。Knight等报导应用此法检测梅毒患者血清有很好的敏感性(95.8%~100%)和特异性(99.1%~100%)。但由于试剂成本较高且需要特殊仪器,当前未在临床得到广泛应用。3、分子生物学技术随着分子生物学技术的飞速发展,应用PCR技术检测梅毒螺旋体DNA已在临床得到应用。现PCR诊断梅毒的方式方法主要有常规PCR、多重PCR、实时荧光定量PCR、RT-PCR(反转录PCR)、巢式PCR。Liu等应用PCR技术检测生殖器溃疡标本polA基因,敏感性为95.8%,特异性为95.7%。Leslie等应用实时荧光定量PCR检测患者标本polA基因,敏感性为80.39%,特异性为98.40%。PCR技术敏感性高,但存在难于标准化的问题,其原因主要是由于引物来源不同以及各实验室间DNA抽提方式方法存在差异不同,且临床标本成分复杂,也进一步导致了该法难于标准化。所以建立对梅毒螺旋体高度特异的PCR方式方法尤为重要。PCR技术是梅毒血清学试验的有益补充,在早期梅毒诊断中发挥重要作用。综上所述,应根据研究目的选择恰当的试验方式方法。当前,国内实验室在进行梅毒常规筛查及疗效观察、判定复发及再感染时常采用梅毒非特异性血清学试验(RPR、TRUST等);各期梅毒确实诊试验常采用梅毒的特异性血清学试验(TPPA、TPHA等);进行大规模梅毒筛查常采用双抗原夹心法ELISA。随着检测