第五章固相析出分离法

目标掌握：盐析的原理及影响因素；有机沉淀的原理、常用有机溶剂，等电点沉淀的机制饱和溶液和过饱和溶液的概念熟悉：盐析的操作过程和注意事项；有机沉淀操作条件的控制，操作过程中应注意事项结晶的一般步骤了解：其他沉淀法第五章固相析出分离法

一、概述1.定义——改变溶液条件使目标产物或杂质的溶解度降低而形成固体沉淀从溶液中分出的操作技术

析出物为晶体时称为结晶，析出物为无定形固体时称沉淀法2.特点——浓缩倍数高、操作简便、经济、纯化倍数低3.缺点：针对复杂体系而言，分离度不高、选择性不强4、类型盐析沉淀法有机溶剂沉淀法等电点沉淀法高分子聚合物沉淀法金属离子沉淀法6)结晶法一般沉析操作的过程Step1

在经过滤或离心后的样品中加入沉析剂；Step2沉淀物的纯化，促进晶体生长；Step3

离心或过滤，收集沉淀物；沉析器二、盐析沉淀法

1.定义——是利用各种生物分子在浓盐溶液中溶解度的差异，通过向溶液中引入一定数量的中性盐，使目的物或杂蛋白以沉淀析出，达到纯化目的的方法。★盐析法应用最广的是在蛋白质领域，已有八十多年的历史,除了蛋白质和酶以外，多肽、多糖和核酸等都可以用盐析法进行沉淀分离，20％～40％饱和度的硫酸铵可以使许多病毒沉淀，43％饱和度的硫酸铵可以使DNA和rRNA沉淀盐析原理首先需要了解生物大分子在水溶液中的存在状态：两性电解质，由于静电力的作用，分子间相互排斥，形成稳定的分散系蛋白质周围形成水化膜，保护了蛋白质粒子，避免了相互碰撞Electricdoublelayer盐析过程当中性盐加入蛋白质分散体系时可能出现以下两种情况：（1）“盐溶”现象—低盐浓度下，蛋白质溶解度增大（2）“盐析”现象—高盐浓度下，蛋白质溶解度随之下降，原因如下：无机离子与蛋白质表面电荷中和，形成离子对，部分中和了蛋白质的电性，使蛋白质分子之间的排斥力减弱，从而能够相互靠拢；中性盐的亲水性大，使蛋白质脱去水化膜，疏水区暴露，由于疏水区的相互作用导致沉淀；盐析用盐的选择在相同离子强度下，盐的种类对蛋白质溶解度的影响有一定差异，一般的规律为：半径小的高价离子的盐析作用较强，半径大的低价离子作用较弱（Ks）磷酸钾>硫酸钠>硫酸铵>柠檬酸钠>硫酸镁盐析剂的选择盐析剂的条件盐析作用强：盐析能力—阴离子＞阳离子；高价阴离子＞低价阴离子较大溶解度生物学上是惰性的来源丰富、经济常用盐析剂—(NH4)2SO4

、Na2SO4、磷酸盐等影响盐析的因素无机盐的种类溶质种类的影响：不同蛋白质所需无机盐不同溶质浓度的影响：蛋白质浓度大，盐的用量小，但共沉作用明显，分辨率低；蛋白质浓度小，盐的用量大，分辨率高；pH值：影响蛋白质表面净电荷的数量通常调整体系pH值，使其在pI附近；盐析温度：一般在高盐浓度下，温度升高，其溶解度反而下降盐析用盐的用量选择饱和度（Saturation）的概念：以硫酸铵为例：250C时，硫酸铵的饱和溶解度是767g/L定义为100%饱和度盐析操作方式及方法操作方式固体盐加入饱和盐溶液加入饱和度方法分步盐析重复盐析反抽提法盐析沉淀法的特点

沉淀条件温和，不会引起生物物质变性失活；非蛋白的杂质夹带沉淀很少；适用范围广；盐份含量高。

突出的优点是：①成本低，不需要特别昂贵的设备。②操作简单、安全。③对许多生物活性物质具有稳定作用。有机溶剂沉淀概念：在含有溶质的水溶液中加入一定量亲水的有机溶剂，降低溶质的溶解度，使其沉淀析出。原理：（1）降低了溶质的介电常数，使溶质之间的静电引力增加，从而出现聚集现象，导致沉淀。（2）由于有机溶剂的水合作用，降低了自由水的浓度，降低了亲水溶质表面水化层的厚度，降低了亲水性，导致脱水凝聚。有机溶剂的选择介电常数要小对生物分子的变性作用小与水互溶安全、无毒、价廉、易回收等常用的有机溶剂沉析剂乙醇：沉析作用强，挥发性适中，无毒常用于蛋白质、核酸、多糖等生物大分子的沉析；丙酮：沉析作用更强，用量省，但毒性大，应用范围不广；特点：介电常数小，60%乙醇的介电常数是48 丙酮的介电常数是22容易获取有机溶剂沉淀的特点分辨能力比盐析法高，即一种蛋白质或其他溶质只在一个比较窄的有机溶剂浓度范围内沉淀。沉淀不用脱盐，固液分相容易，有机溶剂易祛除易使蛋白质变性失活安全性差成本较高影响有机溶剂沉析的主要因素温度：大多数生物大分子如蛋白质、酶和核酸在有机溶剂中对温度特别敏感，温度稍高就会引起变性，且有机溶剂与水混合时产生放热反应，因此有机溶剂必须预先冷至较低温度，操作要在冰盐浴中进行，加入有机溶剂时必须缓慢且不断搅拌以免局部过浓搅拌速度：散热溶液pH值：有机溶剂沉淀适宜的pH值，要选择在样品稳定的pH值范围内，而且尽可能选择样品溶解度最低的pH值，通常是选在等电点附近，从而提高此沉淀法的分辨能力。原则是避免目标蛋白与杂质带有相反的电荷，防止共沉现象。离子强度:少量的中性盐对蛋白质变性有良好的保护作用，但盐浓度过高会增加蛋白质在水中的溶解度，降低了有机溶剂沉淀蛋白质的效果，通常是在低盐或低浓度缓冲液中沉淀蛋白质，0.01~0.05mol/L样品浓度:0.5~2%，

稀：溶剂用量大，样品的损失较大，回收率低，具有生物活性的样品易产生稀释变性。但共沉淀作用小

浓：节省溶剂用量，减少变性的危险，共沉作用强，分辨率低，分离效果下降，有利于提高分离效果。金属离子的助沉析作用：Zn2+、Ca2+等电点沉淀原理： 蛋白质是两性电解质，当溶液pH值处于等电点时，分子表面净电荷为0，双电层和水化膜结构被破坏，由于分子间引力，形成蛋白质聚集体，进而产生沉淀。概念：

利用两性生物物质在等电点时溶解度最小而析出固相物的过程特点1.沉淀条件温和；2.不引入新的物质；3.沉淀效果差。由于许多蛋白质的等电点十分接近，而且带有水膜的蛋白质等生物大分子仍有一定的溶解度，不能完全沉淀析出，因此，单独使用此法分辨率较低，效果不理想，因而此法常与盐析法、有机溶剂沉淀法或其他沉淀剂一起配合使用，以提高沉淀能力和分离效果。此法主要用于在分离纯化流程中去除杂蛋白，而不用于沉淀目的物成盐类复合物沉析剂此类沉析剂有以下三种：（1）高价金属盐：Cu2+，Ag2+，Zn2+，Ca2+ 与酸性基团结合；（2）苦味酸盐、单宁酸盐、鞣质等，与碱性基 团结合（3）无机复合盐：磷钨酸盐、磷钼酸盐等缺点：容易导致活性蛋白的不可逆变性特点沉淀效果很好；容易使生物分子变性复合物难分解高分子聚合物沉淀法定义—利用一些水溶性高分子聚合物使目的物溶解度降低而析出固相物的过程有机聚合物是六十年代发展起来的一类重要的沉淀剂，最早应用于提纯免疫球蛋白和沉淀一些细菌和病毒。近年来广泛用于核酸和酶的纯化。应用最多的是聚乙二醇（PEG)，它的亲水性强，溶干水和许多有机溶剂，对热稳定，有广泛围的分子量，在生物大分子制备中，用的较多的是分子量为6000～20000的PEG。

特点沉淀效果较好，使用很少量的PEG即可以沉淀相当多的生物大分子，条件温和高聚物的残留有一定的毒性（阳离子）沉淀机理①沉淀作用是聚合物与生物大分子发生共沉淀作用。②由于聚合物有较强的亲水性，使生物大分子脱水而发生沉淀③聚合物与生物大分子之间以氢键相互作用形成复合物，在重力作用下形成沉淀析出。

离子型表面活性剂十六烷基三甲基季铵盐的溴化物（CTAB） 主要用于沉淀酸性多糖十二烷基磺酸钠（SDS） 主要用于沉淀膜蛋白和核蛋白结晶的概念溶液中的溶质在一定条件下，因分子有规则的排列而结合成晶体，晶体的化学成分均一，具有各种对称的晶体，其特征为离子和分子在空间晶格的结点上呈规则的排列固体有结晶和无定形两种状态结晶析出速度慢，溶质分子有足够时间进行排列，粒子排列有规则无定形固体析出速度快，粒子排列无规则结晶操作的特点只有同类分子或离子才能排列成晶体，因此结晶过程有良好的选择性。通过结晶，溶液中大部分的杂质会留在母液中，再通过过滤、洗涤，可以得到纯度较高的晶体。结晶过程具有成本低、设备简单、操作方便，广泛应用于氨基酸、有机酸、抗生素、维生素、核酸等产品的精制。结晶过程分析——几个概念饱和溶液：当溶液中溶质浓度等于该溶质在同等条件下的饱和溶解度时，该溶液称为饱和溶液；过饱和溶液：溶质浓度超过饱和溶解度时，该溶液称之为过饱和溶液；溶质只有在过饱和溶液中才能析出；结晶过程的实质结晶是指溶质自动从过饱和溶液中析出，形成新相的过程这一过程包括：溶质分子凝聚成固体分子有规律地排列在一定晶格中这一过程与表面分子化学键力变化有关；因此，结晶过程是一个表面化学反应过程。结晶的步骤过饱和溶液的形成晶核的形成晶体生长其中，溶液达到过饱和状态是结晶的前提；过饱和度是结晶的推动力。过饱和溶液的形成

蒸发法温度诱导法盐析法这是生化制药中应用最多的结晶方法。其作用是通过向结晶溶液中引入中性盐，逐渐降低溶质的溶解度使其过饱和，经过一定时间后晶体形成并逐渐长大。4.透析法5.有机溶剂结晶法6.等电点法7.微量扩散法8.化学反应结晶法

9.共沸蒸馏结晶提高晶体质量的方法晶体质量包括三个方面的内容： 晶体大小、形状和纯度影响晶体大小的因素： 过饱和度、温度、晶核质量、搅拌等影响晶体形状的因素： 改变过饱和度、改变溶剂体系、杂质影响晶体纯度的因素：母液中的杂质、结晶速度、晶体粒度及粒度分布晶体结块晶体结块是一种导致结晶产品品质劣化的现象，导致晶体结块的主要原因有：结晶理论：由于某些原因造成晶体表面溶解并重结晶，使晶粒之间在接触点上形成固体晶桥，呈现结块现象；毛细管吸附理论：由于晶体间或晶体内的毛细管结构，水分在晶体内扩散，导致部分晶体的溶解和移动，为晶粒间晶桥的形成提供饱和溶液，导致晶体结块。重结晶经过一次粗结晶后，得到的晶体通常会含有一定量的杂质。此时