第十四章、显微摄影(2015.10.19)

第十四章

显微摄影技术

(photomicrography)组织胚胎学教研室周莉

显微摄影技术

什么是显微摄影技术？是指利用显微照相装置把显微镜下观察到的图像拍摄下来制成照片，长期保存研究结果，以便进一步研究和交流。2.为什么要学习显微摄影技术？

一是要保存研究结果；二是要真实地记录研究结果。第一节摄影基础显微摄影是摄影学的一个分支，其基本原理相同，方法也有相似之处。故首先学习摄影的基础知识。一、照相机镜头和成像原理镜头是照相机的关键部件，最早的照相机没有镜头。1839年由巴黎的达盖尔(Daguerre)利用显影的概念发明了摄影术。照相机镜头和成像原理镜头的透镜片组镜头成像原理图（一）镜头的焦距（focallength)

从镜头的中心点到形成清晰影像的胶片或数码CCD之间的距离。以F等于某数来表示，如F=50意旨50毫米焦距的镜头。（二）镜头的有效孔径

即镜头的最大光圈（光圈是安装在镜头上，用于控制光线的孔径光阑），是表示镜头最大进光量的参数，其大小与镜头的最大直径和焦距有关。

最大光孔直径（25mm）1：2，F2

焦距（50mm）最大光孔直径（35mm）1：1.4，F1.4焦距（50mm）(三）镜头的视角一般来说，相机的胶片和CCD的大小是固定的，因此视角大小有镜头的焦距长度所决定，焦距越短，视角越大，焦距越长，视角越小。焦距的长短决定视角的大小（四）景深与焦深概念：是指拍摄对象的最近清晰点至最远清晰点之间的范围。

前景深：被摄物前的一段清晰范围；

后景深：被摄物后的一段清晰范围；景深：前景深加后景深。景深受三个因素影响：光圈的大小，镜头焦距的长短，物距远近。景深长景深短虚化背景（景深短）（五）镜头的种类根据相机镜头的焦距长短及其与胶片画幅的对角线长度的关系，将镜头分为标准镜头、广角镜头、远摄镜头和中焦镜头等。1.标准镜头焦距约等于拍摄胶片画幅对角线的长度，换言之，覆盖135胶片（24mm×36mm)大小的影像所需的焦距镜头，称标准镜头，为50mm，视角43°。镜头焦距越长，产生覆盖胶片的影像就越大。焦距焦点距离2.广角镜头：焦距短于胶片对角线的镜头，其焦距短于标准镜头，视场角度大，135相机的广角镜头焦距一般为17mm-35mm，视角越大，景深也随之增大。3.远摄镜头又称长焦距镜头，焦距长于底片对角线的镜头，焦距长于200mm以上，视角在8度以下。4.中焦距镜头又称“肖像镜头”焦距在80-135mm,小于85mm的镜头拍摄，肖像容易变形，而大于135mm的镜头拍摄肖像容易产生面部扁平，只有用中焦距镜头拍摄，才逼真和自然。

照相机镜头种类与焦距焦距在摄影中的功能1.对被摄物的调焦，决定于照片的清晰度；2.焦距的长短决定视角的大小；3.景物影像的大小；4.景深的长短；5.影像变形的程度。二、感光胶片（Film)

是通过相机的光学镜头把拍摄的景物在感光乳胶上记录下来，感光乳剂随着光线的强弱发生不同变化而产生“潜影”，再通过冲洗，潜影就转变为可见的影像。感光乳剂的主要成分时卤化银和明胶。黑白胶片最后形成的影像由金属颗粒构成，彩色胶片形成的影像由染料构成。

1.感光度（sensitivity)

是胶片的感光速度，即胶片对光线照射时的反应能力。感光度高，卤化银颗粒较大，吸收光线的能力强，反之，感光度低，卤化银颗粒较小，吸收光线的能力弱，所以，感光度的高低取决于胶片乳剂的制备和加工工艺。在光线较弱的环境下拍摄，常使用高感光度胶片。但是，感光度高的胶片产生的影像颗粒较大，质感欠细腻和反差小；而低感光度胶片产生的影像颗粒较细，反差较大，所形成的影像质感细腻。感光度的表示法：美国的“ASA制”，德国的“DIN制”，中国的“GB制”，后两者表示的感光度数值相同，国际标准感光度（1980）用ISO表示：ISO100/21°，200/24°，400/27°。三、反差照片中不同部分的明暗差别程度称反差，明暗对比强烈，则反差大，反之，则反差小。被摄物各部分的亮度差和色彩饱和度直接影响反差的大小。

反差小反差大曝光不足与曝光过度的比较

曝光不足曝光过度四、曝光控制

欲得到理想的照片曝光是关键，影响曝光因素有三个：光圈、快门和胶片感光度。前两者决定进入光线的多少，后者决定于胶片对光线的反应速度。（一）光圈（Aperture）由若干金属薄片组成，安装在镜头内部，可均匀地自由开合，以调节镜头的相对口径，控制进光量。一般来说，相机采用光圈系数表示口径的大小。光圈系数（f系数）：标志镜头的相对口径系数英国制：f2、f2.8、f4、f5.6、f8、f11、f16、f22、f32等。数字越大，光圈越小，可用“2n”计算任意两档光圈进光量的倍率关系，n为两档之间相差的档数，如f2与f8相差4档，24=16即f2进光量是f8的16倍。

调节景深，光圈小，景深长，光圈大，景深短；调节焦点深度；调节反差，光圈小，反差大，光圈大，反差小；。最佳光圈：镜头的分辨率和影像反差均处于最佳状态，一般来说，把镜头的最大光圈收缩三档为该镜头的最佳光圈。最大光圈是f2，收缩三档，最佳光圈是f5.6

2、2.8、4、5.6、8、11、16光圈的几个其他作用

大光圈可虚化背景小光圈的应用（二）快门

（Shutter）

快门：是光圈的开启时间,用来控制胶片曝光时间长短的装置。快门的开启时间长短与曝光量的多少成正比。用某些数字的倒数秒来表示，如1/30秒、1/60秒、1/125秒等。

f系数与快门之间存在一种倒易率关系，即如果快门速度降低，光圈必须缩小，才能获得等量的曝光。下面的组合会产生完全相同的胶片曝光量：f16与1/30;f11与1/60;f8与1/125;f5.6与1/250;f4与1/500。从曝光均匀这一意义来讲，用小光圈慢速度，比用大光圈快速度为好。从快门本身性质来讲，也是慢速度比快速度好。理想的快门速度：1/60-1/100秒。如何选择一组合适的光圈和快门速度组合？依据不同的需要：1.景深的需要（使用光圈优先）；2.扑捉运动物体的影像，使其不动或使其有动感。

（使用快门优先）机械快门与电子快门：

快速快门慢速快门-1慢速快门-2慢速快门-3五、色温

(colortemperature)色温:是指色质，即白光的程度。所谓白光，就是日光、灯光、天空光等。摄影所用的光源有色温，彩色胶片中的感光乳剂对色温有一定要求,彩色胶片一般分两类：即日光片与灯光片。日光片适合于5400K(±1200)的色温下拍照，而灯光片适合于3200K(±700)下拍照。如何求得色温平衡？如何利用色温不平衡？利用低色温拍照利用高色温拍照B门曝光六、滤色镜的应用(filter)（一）原色光和补色光指光的三原色，即红、绿、蓝。

补色光：摄影学光的三原色中，两种色等量相混得出一个新的颜色，称为补色。红加绿等于黄；蓝加绿等于青；红加蓝等于品红；同样，有时将三原色与三补色相互对应的颜色称互补色，即：绿与品红为互补色；黄与蓝为互补色；红与青为互补色。三原色和互补色三原色：红、绿、蓝三补色：黄、青、品红互补色：绿与品红，黄与蓝，红与青（二）滤色镜的特性1.吸收补色；蓝色滤色镜吸收黄色2.限制补色邻近色;蓝色滤色镜限制红色3.通过相同色。(三)滤色镜在摄影中的应用1.校正颜色对比

2.调整反差：与被摄物颜色互补的滤色镜可使反差加大。3.消除或突出某种颜色4.校正色温的作用：如光的色温与底片色温不相符，可用滤色镜校正。滤光镜的特性（通过相同色）校正色温（用日光片在灯光下拍照）中灰渐变镜和偏振光镜第二节显微摄影基本方法一、显微镜的几何光学成象原理照明光源聚光镜聚焦物镜目镜（入射光）（聚焦到标本上）（焦平面）

（聚焦）普通显微镜与特殊显微镜传统显微摄影与数码显微摄影

放大再放大一、物镜与目镜的选用

物镜的分辨率就是显微镜的分辨率，目镜与显微镜的分辨率无关；故物镜是衡量一台显微镜成像质量的重要标准。

（一）物镜的选用以分辨率为首选指标，数值孔径的大小决定物镜的分辨率，数值孔径越大，分辨率越高，但大于40倍的物镜，其景深范围较小，不能拍摄到标本全层。

物镜种类很多，根据物镜像差校正程度可分为全复消色差物镜、半复消色差物镜和消色差物镜。全复消色差物镜可将可见光谱中的红、绿、黄聚焦于一点改善球差和像差；平场物镜可校正像场弯曲，不存在视野中心与边缘不同时聚焦的现象。故平场复消色差物镜的成像质量最好。可根据实际需要选用合适的物镜。（二）目镜的选用

目镜的作用是把物镜映来的的影像进一步放大，同时矫正物镜成像中的像差和色差。

物镜的标识（三）聚光镜（condenser）聚光镜的其作用在于将光源发散的光，有效地产生与物镜相适应的光束，造成一个明亮而又均匀的视场。它同时也影响分辨率、对比度、景深和光亮度，而这些因素又直接影响显微成像质量。聚光镜的种类：1．阿贝聚光镜2．消色差聚光镜：不适用于4倍以下的低倍物镜，否则照明光源不能充满整个视场。3．旋出式聚光镜

二、光路合轴摄影前应检查照明光源与显微镜光轴是否在一条直线上，方法：注意整个视野的光亮度是否一致，如不一致，需光路合轴。方法如下：（1）聚光器升到最高，4倍物镜，视场光阑收缩到最小，调节聚光器至视野中视场光阑边缘清晰；（2）转动聚光器两个调中螺旋杆将收缩的视场光阑图像调至视野中心。三、光阑的调节

显微镜有孔径光阑和视场光阑两种，物镜的数值孔径与聚光镜的数值孔径相等时，物镜的分辨率最高。聚光镜的数值孔径受孔径光阑的控制。（一）孔径光阑的调节位于聚光镜的透镜组之间，显微摄影的影像反差和景深可随孔径光阑的缩小而提高，当孔径光阑小于物镜的数值孔径时，影像的反差和景深提高，影像更加清晰。所以当孔径光阑调整至物镜数值孔径的60%-80%时能获得良好的显微图像。孔径光阑与视场光阑（二）视场光阑的调节

在正置显微镜，视场光阑位于镜座之中，用于控制照明光束的直径，即控制照野，提高显微图象的清晰度。

视场光阑的调节方法：将视场光阑收缩到最小位置，在标本平面中心处看到一个呈正多边形的光斑，此为视场光阑的图像。将其开到比取景框略大的位置为好。五、曝光补偿显微镜摄影装置均有自动测光和自动曝光装置，只要正确输入胶片的感光度一般都能获得正确曝光。但是，当背景过亮或背景过暗，标本面积过小时，依据自动曝光装置将会曝光不足或曝光过度。在这两种极端情况下，需使用曝光补偿。方法：

-3-2-10123曝光补偿的应用闪光灯的应用（近距离时）荧光显微镜曝光补偿的应用

曝光过度使用曝光补偿减少曝光量后六、显微摄影的基本步骤

（一）显微镜的使用环境

1.远离动源；

2.室内光线不能太亮；

3.防尘、防潮、防霉。（二）摄影前准备

1．光路合轴调节

；

2．柯勒照明调节

使观察的视野获得均匀而又充分的照明；

3．物镜与目镜合理组合

4．色温的设定：将中灰滤色镜（ND）、色温平衡滤色镜（NCB）放入光路中；5．瞳距及屈光度的调节：使左右两个视场合二为一；7．观察时的调节（1）将欲观察标本置于载物台上，使选用的物镜进入光路，并对标本对焦；（2）调整聚光镜，并按上一步骤对视场光阑进行调节；（3）将孔径光阑缩至物镜数值孔径的60%～80%。8．调焦和取景（一）倍数表示法（二）比例尺表示法（scalebar)Bar=20μm八、显微照片放大倍数的计算第三节数码显微摄影技术

数码显微摄影是用数码相机替代传统的胶片相机进行显微镜下摄影的一种方法。一、数码摄影基础

传统摄影是靠胶片上银盐的光化学反应来记录通过光学镜头的影像，而数码摄影是将通过光学镜头的影像信号转化为可由电脑处理的数码信息（即数字信息）。它记录影像不使用胶片，而采用CCD等影像传感器来接受影像信号。（一）影像传感器1.CCD是光电耦合元件（ChargeCoupledDevice）的简称，具有光电转换功能。成像原理：CCD是由数百万只微型光电二极管感光组件构成，通常排列成小面积的长方形，在CCD上每一只光电二极管感受投射到它表面的光线强度，并将光信号转变为电信号，产生电荷。光强弱不同，产生的电荷也不同。所以，每只光电二极管感受不同的光线强度，产生不同的电荷。2.CMOSCMOS（ComplementMetalOxideSemiconductor）,意为“互补性氧化金属半导体”。是计算机内重要记忆芯片，也可加工成数码相机的感光元件。CMOS的集成度高，可以把许多电路集成在单一芯片上，例如，信号处理、模/数转换、放大电路、时钟驱动等，而这些在CCD的数码相机上均为分离的芯片。因而，CMOS成本低，耗电少。CMOS的主要缺点，一是噪音较大，易在数码影像上引起杂点；二是敏感性较低，影响“ISO感光度”的提高。（二）影像传感器像素

CCD或CMOS上每一个光敏单元对应图像中的一个点，这个点即为像素（pixed),是形成影像的最小单位。像素的多少决定于数码相机的分辨率，是表示相机档次的主要依据之一。但并不是唯一标准。表示方法：①陈列表示法：即“横、纵像素的乘积”，例如，像素640×480，像素1024×768；②总量表示法：如像素100万，300万等。

内插值只是将CCD的像素总量通过某种软件进行一定程度的软化模糊处理，再在影像相同部位的空隙进行填充来增加像素。这种经内插处理后，CCD本身像素并没有改变，也不能从根本上提高影像的最终质量。例如，CCD本身像素300万，经“内插”标称像素总量达到500万。这种500万的内插值与本身具有500万像素的CCD质量不能等同。

（三）相当感光度此概念并非完全指它对光线的敏感性能。拍摄时影像传感器产生的信号在进行模/数转换前需要进行放大，当提高数码相机感光度拍摄时，图象传感器输出的信号并未改变，只是改变了信号的放大倍率，实际上并未影响到影像传感器本身。使用方法与传统相机相同，在荧光显微镜摄影时常用，一般调节到ISO200以上。当ISO过大时，会引起过多的“噪声”，表现为杂点增多。（四）白平衡

白平衡功能是一种针对不同光照环境的颜色纠正功能，是让白色的物体在不同光照环境下依然呈现白色的功能。它的作用类似传统相机彩色摄影中校正色温滤光镜，用以获取准确的色彩还原。数码相机有自动（2500-6500K)、自定义与手动白平衡功能。（五）数码图片数码图片的主要指标（1）图片大小：图像尺