第十一章荧光分析方法

第十一章荧光分析方法1

有些物质受到光照射时，除吸收某种波长的光之外还会发射出比原来所吸收光的波长更长的光，这种现象称为光致发光。最常见的光致发光现象是荧光和磷光。荧光是物质分子接受光子能量被激发后，从激发态的最低振动能级返回基态时发射出的光。荧光分析法是根据物质的荧光谱线位置及其强度进行物质鉴定和含量测定的方法。23荧光分析法的特点（1）灵敏度高比紫外-可见分光光度法高2～4个数量级检测下限：0.1～0.1μg/cm-3（2）选择性强既可依据特征发射光谱，又可根据特征吸收光谱；（3）试样量少缺点：应用范围小。3第一节荧光分析法的基本原理

一、分子荧光

（一）分子荧光的产生

1.分子的电子能级与激发过程在基态时，分子中的电子成对地填充在能量最低的各轨道中。根据Pauli不相容原理，一个给定轨道中的两个电子，必定具有相反方向的自旋，即自旋量子数分别为1／2和-1／2；其总自旋量子数s等于0，即基态没有净自旋。

4

电子能级的多重性可用M＝2s+1表示，当s＝0时，分子的多重性M＝1，此时分子所处的电子能态称为单重态，用符号S表示。当s＝1时，分子的多重性M＝3，此时分子所处的电子能态称为三重态。用符号T表示。

当基态的一个电子吸收光辐射被激发而跃迁至较高的电子能态时，通常电子不发生自旋方向的改变，即两个电子的自旋方向仍相反，总自旋量子数s仍等于0，这时分子处于激发单重态(2s+1＝1)。

S0+hν→S15

在某些情况下，电子在跃迁过程中还伴随着自旋方向的改变，这时分子的两个电子的自旋方向相同，自旋量子数都为1／2，总自旋量子数s等于1，这时分子处于激发三重态(2s+1＝3)。S0+hν→T167激发单重态与激发三重态的区别：激发单重态分子是抗磁性分子，激发三重态分子是顺磁性分子；激发单重态的平均寿命大约10-8s，激发三重态的平均寿命大约10-4~1s；电子由S0→S1，S2等的跃迁较容易，属于允许跃迁。电子由S0→T1，T2等的跃迁较难发生，属于禁阻跃迁。激发三重态比激发单重态能级稍低一些。7

2.荧光的产生分子的去激发：分子中处于激发态的电子以辐射（发光）跃迁方式或无辐射跃迁方式回到基态。辐射跃迁：荧光或磷光无辐射跃迁：振动驰豫、内转移、体系间跨越、外转移。8（1）无辐射跃迁：①振动弛豫(vibrationrelexation):处于激发态各振动能级的分子通过与溶剂分子的碰撞而将部分振动能量传递给溶剂分子，其电子则返回到同一电子激发态的最低振动能级的过程。

振动弛豫过程很快，约10-12~10-14s

在其他去激发过程发生之前，电子已首先完成了由较高能级跃迁至同一电子能级的最低振动能级的振动弛豫过程。9②内部能量转换（内转换internalconversion）是当两个电子激发态之间的能量相差较小以致其振动能级有重叠时，受激分子常由高电子能级以无辐射方式转移至低电子能级的过程。③外部能量转换（外转换externalconversion）是溶液中的激发态分子与溶剂分子或与其他溶质分子之间相互碰撞而失去能量，并以热能的形式释放能量的过程。外转换常发生在第一激发单重态或激发三重态的最低振动能级向基态转换的过程中。外转换会降低荧光强度。

10④体系间跨越(intersystemcrossing)：是处于激发态分子的电子发生自旋反转而使分子的多重性发生变化的过程。

如S1→T1，S1上的受激电子发生自旋方向变化而变成T1，即可通过自旋-轨道耦合而产生无辐射跃迁。如果两个电子能级态（如S1与T1)的振动能级相重叠，则发生体系间跨越的几率将增大。体系间跨越常见于含有重原子（如碘、溴等）的有机分子。11（2）辐射跃迁①荧光发射：分子最初处于激发单重态，通过内转换及振动弛豫，均可返回到第一激发单重态的最低振动能级，然后再以辐射形式发射光量子而返回至基态的任一振动能级上，这时发射的光量子称为荧光。

S1→S0+hνF

荧光发射的时间10-9~10-7s

荧光波长大于激发波长（Stokes效应）12②磷光(phosphorescence)发射：经过体系间跨越的分子再通过振动弛豫降至激发三重态的最低振动能级，分子在激发三重态的最低振动能级可以存活一段时间，然后返回至基态的各个振动能级而发出光辐射，这种光辐射称为磷光。

T1→S0+hνp

磷光发射时间较长，约10-4-10s。激发光停止后，磷光可持续一段时间。电子由S0→T1为禁阻跃迁，需由S1经过体系间跨越转化为T1。同一分子的S1→S0

比T1→S0

的能级差大，磷光的波长比荧光波长长1314S2S1S0T1吸收发射荧光磷光系间跨越内转换振动弛豫能量λ

2λ1λ

3

外转换λ

2T2内转换振动弛豫分子内的光物理过程1415荧光与磷光的不同点：跃迁时重度不同。荧光：S1→S0重度未变。磷光：T1→S0重度改变。辐射强度不同。荧光：强度较大，因从S0→S1是自旋允许的，处于S1，S2态电子多，因而荧光亦强。磷光：很弱，因为S0→T1是自旋禁阻的，处于T1态电子少。寿命不同。荧光：10-9~10-7s，寿命短。磷光：10-4~100s，寿命稍长。15（二）荧光的激发光谱和荧光光谱1.激发光谱激发光谱表示不同激发波长的辐射引起物质发射某一波长荧光的相对效率。绘制激发光谱曲线时，固定发射单色器在某一波长，通过激发单色器扫描，以不同波长的入射光激发荧光物质，记灵荧光强度(F)对激发波长(λex)的关系曲线，即激发光谱，其形状与吸收光谱极为相似。162.荧光光谱：荧光光谱表示在所发射的荧光中各种波长组分的相对强度。绘制发射光谱时，使激发光的波长和强度保持不变，通过发射单色器扫描以检测各种波长下相应的荧光强度，记录荧光强度(F)对发射波长(λem)的关系曲线，即荧光光谱。

激发光谱和荧光光谱可用来鉴别荧光物质，而且是选择测定波长的依据。1718溶液荧光光谱通常具有如下特征：（1）斯托克斯位移荧光发射波长总是大于激发光波长的现象。原因：①激发态分子通过内转换和振动弛豫过程而迅速到达第一激发单重态s1*的最低振动能级；②荧光发射可能使激发态分子返回到基态的各个不同振动能级．然后进一步损失能量；③激发态分子与溶剂分子的相互作用。19（2）荧光光谱的形状与激发波长无关（3）荧光光谱与激发光谱的镜像关系20二、荧光与分子结构（一）荧光寿命和荧光效率

1．荧光寿命(fluorescencelifetime)：当除去激发光源后，分子的荧光强度降低到最大荧光强度的l／e所需的时间，常用τ表示。当荧光物质受到一个及其短暂的光脉冲激发后，它从激发态到基态的变化可用指数衰减定律表示：F0和Ft分别是在激发时t＝0和激发后时间t时的荧光强度，K是衰减常数。21假定在时间t＝τf时测得的Ft为F0的1/e，即Ft＝(1／e)F0，则：

如果以1nF0/Ft对t作图，直线斜率即为1/τf，此可计算荧光寿命。利用分子荧光寿命的差别，可以进行荧光物质混合物的分析。222．荧光效率(fluorescenceefficiency)又称荧光量子产率(fluorescencequantumyield)

激发态分子发射荧光的光子数与基态分子吸收激发光的光子数之比，常用φf表示；23（二）有机化合物分子结构与荧光的关系

能够发射荧光的物质同时具备两个条件：即有强的紫外—可见吸收和一定的荧光效率。

1．长共扼结构绝大多数能产生荧光的物质都含有芳香环或杂环、因为芳香环和杂环分子具有长共轭的π—π*跃迁。π电子共轭程度越大，荧光强度(荧光效率)越大，而荧光波长也长移。242．分子的刚性

在同样的长共轭分子中，分子的刚性越强，荧光效率越大，荧光波长产生越长。芴（φf=1.0）联苯（φf=0.2）2，2’-二羟基偶氮苯（无荧光）配合物（荧光）253．

取代基：a增加分子的π电子共轭程度，常使荧光效率提高，荧光波长长移．如-NH2、-OH、-OCH3、-NHR、-CN、-NR2等；常为给电子取代基b减弱分子的π电子共轭程度，使荧光减弱甚至熄灭，如-COOH、

-NO2

、-C=O、-NO、-SH、-NHCOCH3、-X等；常为吸收电子取代基c对π电子共轭体系作用较小，如：-R、-SO3H、-NH3+等，对荧光的影响也不明显。26（三）荧光试剂为了提高测定的灵敏度和选据性，常使弱荧光物质与某些荧光试剂作用，以得到强荧光性产物，扩大荧光分析法的应用范围。

1．荧光胺能与脂肪族和芳香族伯胺形成高度荧光衍生物。

2．邻苯二甲醛(OPA)与伯胺类、特别是半胱氨酸、脯氨酸及羟脯氨酸外的α-氨基酸生成灵敏的荧光产物。

3．1-二甲氨基-5-氯化磺酰萘能与伯、仲胺及酚基的生物碱反应生成荧光产物

4．测定无机离子的荧光试剂27

三、影响荧光强度的外部因素

1.温度：在一般情况下，随着温度的升高，溶液中荧光物质的荧光效率和荧光强度将降低。

2.溶剂：一般情况下，溶剂极性增加，荧光波长发生红移，荧光强度增加。溶剂粘度降低，降低分子的荧光强度。28

3.酸度：具酸或碱性基团的有机物质，在不同pH值时，其结构可能发生变化，因而荧光强度将发生改变；pH<2无荧光pH=7~12蓝色荧光pH>13无荧光对无机荧光物质，因pH值会影响其稳定性，因而也可使其荧光强度发生改变。29

4．荧光熄灭剂荧光熄灭又称荧光淬灭指荧光物质分子与溶剂分子或其他溶质分子相互作用引起荧光强度降低的现象。荧光熄灭剂引起荧光熄灭的物质卤素离子、重金属离子、氧分子以及硝基化合物、重氮化合物、碳基和羧基化合物均为常见的荧光熄灭剂。30荧光熄灭的原因：①荧光物质的分子和熄灭剂分子碰撞而损失能量；②荧光物质的分子与熄灭剂分子作用生成了本身不发光的配位化合物；③溶解氧的存在，使荧光物质氧化，或是由于氧分子的顺磁性，促进了体系间跨越，使激发单重态的荧光分子转变至三重态；④浓度较大(超过1g/L)时，还发生自熄灭现象。31

5．散射光当一束平行单色光照射在液体样品上时，大部分光线透过溶液，小部分由于光子与物质分子相碰撞，使光子的运功方向发生改变而向不同角度散射，这种光称为散射光。光子和物质分子发生弹性碰撞时，发生能量的交换，仅仅是光子运动方向发生改变，这种散射光称为瑞利光。其波长与入射光波长相同。32光子和物质分子发生非弹性碰撞时．在光子运动方向发生改变的同时，光子与物质分子发生能量的交换，光子把部分能量转移给物质分子或从物质分子获得部分能量，而发射出比入射光稍长或稍短的光，这种散射光称为拉曼光。散射光对荧光测定有干扰，尤其是波长比入射光波长更长的拉曼光。选择适当的激发波长可消除拉曼光的干扰。33第二节荧光定量分析方法一、荧光强度与物质浓度的关系荧光强度正比于被荧光物质吸收的光强度34二、定量方法

1.工作曲线（校正曲线)法：用一定量的对照品配制成浓度不同的对照品系列溶液（标准系列溶液），测得对照品系列溶液的荧光强度，绘制荧光强度F对浓度c的标准曲线。然后，测量同样条件供试品溶液的荧光强度，对照标准曲线求出供试品溶液的浓度。35

2．比例法如果荧光分析的校正曲线通过原点，就可选择其线性范围，用比例法进行测定。取已知量的对照品，配置一对照品溶液（CS），使其浓度在线性范围之内，测定荧光强度（FS），然后在同样条件下测定试样溶液的荧光强度（Fx）。按比例关系计算试样中荧光物质的含量（Cx）。在空白溶液的荧光强度不能调到o时．必须从FS及FX值中扣除空白溶液的荧光强度（F0）．然后进行计算。36

3．联立方程式法此法用于多组分混合物的荧光分析。如果混合物中各组分荧光峰相距较远，而且相互之间无显著干扰，则可分别在不同波长处测定各个组分的荧光强度，从而直接求出各个组分的浓度。如果各个组分的荧光光谱相互重叠，可利用荧光强度的加和性质，在适宜的荧光波长处，测定混合物的荧光强度，再根据各组分在该荧光波长处的荧光强度，列出联立方程式，分别求出它们各自的含量。3738三、荧光分析条件的选择1.选择线性范围荧光物质浓度较低时，荧光强度与物质浓度才呈线性关系，应通过一定条件下的标准曲线确定方法的线性范围。高浓度时，由于荧光自熄灭和自吸收等原因，使荧光强度与浓度呈非线性关系。分析时应在线性范围内进行，否则会产生误差。38392.激发光波长λex

由激发光谱选择能产生最强荧光的激发光波长，即最大激发波长，作为分析用的激发光波长，以λex表示。3.荧光波长λem

分析时，应根据荧光光谱选择最强荧光的波长作为荧光测定波长，以λem表示。39404.散射光干扰的排除散射光包括瑞利散射光和拉曼散射光。瑞利散射光的波长与激发光波长相同；拉曼散射光的波长一般情况下比激发波长要长，有时靠近荧光波长。消除方法：①选择适宜的激发波长；②选择合适溶剂。40415.溶剂的选择对于π-π*共轭的荧光物质，宜用极性溶剂。对于n-π*共轭的荧光物质（π电子体系上连有-OH、-COOH、-NH2等），宜用非极性溶剂。6.pH值的选择7.消除荧光猝灭物质干扰41第三节荧光分光光度计一荧光分光光度计

用于测量荧光强度的仪器分类：

⒈滤光片荧光计不能测定光谱，可用于定量分析。

⒉滤光片-单色器荧光计不能测定激发光谱，可测定荧光光谱。

⒊荧光分光光度计可测量某一波长处的荧光强度，还可绘制激发光谱和荧光光谱。42431）光源：氙灯：波长250~700nm。宜连续使用，避免频繁启动。低压汞灯：线状光谱，主要能量集中在紫外光区，其常用谱线为253.7nm，常用它进行单色器的波长校正。高压汞灯：常用谱线为365.0nm。2）单色器：用光栅制成3）样品池：石英（低荧光材料）4）检测器：光电倍增管为减少激发光的杂散光干扰，检测器与激发光方向垂直放置。44二、其他荧光分析技术简介激光诱导荧