第二章基因工程的酶学基础

第二章基因工程的酶学基础主要内容第一节限制性内切核酸酶第二节DNA连接酶第三节DNA聚合酶和反转录酶第四节DNA修饰酶第五节外切核酸酶第六节单链内切核酸酶第七节RNA酶补充：核酶甲基化酶第一节限制性内切核酸酶

(RestrictionEndonuclease,RE)

一、寄主的限制-修饰系统

(R-M,Restriction-modificationsystem)大肠杆菌B大肠杆菌K修饰的phageλ(B)EOP=10-4（限制作用）EOP=10-4（限制作用）EOP=1（修饰作用）修饰的phageλ(K)注：EOP=噬菌体的成斑率第一节限制性内切核酸酶限制(restriction)：指一定类型的细菌可以通过限制性内切核酸酶（限制酶）的作用，破坏入侵的噬菌体DNA，导致噬菌体的寄主幅度受到限制。维护宿主遗传稳定的保护机制。第一节限制性内切核酸酶限制酶：在细胞内能够识别双链DNA分子中的特定核苷酸序列，并对DNA分子进行切割的一种酶。1978年，W.Arber，H.O.Smith，Nathans因发现限制性内切酶及对其功能研究的突出贡献获得诺贝尔生物医学奖。第一节限制性内切核酸酶修饰(modification)：指寄主本身的DNA，由于在合成后通过甲基化酶（甲基转移酶）的作用得以甲基化，使DNA得以修饰，从而免遭自身限制酶的破坏。第一节限制性内切核酸酶第一节限制性内切核酸酶寄主控制的限制与修饰的作用：一是保护自身的DNA不受限制；二是破坏外源DNA使之迅速降解。基因工程中，应用采用缺少限制作用的菌株作为受体。

例如K12：

rk+mk+

rk-mk-（用于转化实验）

rk-mk+（用于转化实验）

rk+mk-（自杀性表型）第一节限制性内切核酸酶根据限制性内切核酸酶的识别切割特性、催化条件及是否具有修饰酶活性，可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型四类。二、限制性内切核酸酶的类型主要特性Ⅰ型Ⅱ型Ⅲ型限制修饰蛋白结构辅助因子识别序列切割位点多功能（具甲基化）异源三聚体ATPMg2+SAM距识别序列1kb处随机性切割单一功能同源三聚体Mg2+

4-6bp回文序列特异切割双功能（具甲基化）异源二聚体ATPMg2+距识别序列下游24-26bp处随机性切割基因工程中广泛使用注：SAM为S－腺苷甲硫氨酸REBASE数据库(http：///)第一节限制性内切核酸酶1.用属名的第一个字母和种名的头两个字母组成3个字母的略语表示寄主菌的物种名。

大肠杆菌（Escherichiacoli）用Eco表示；流感嗜血菌（Haemophilus

influenzae）用Hin表示。2.若该微生物有不同的变种或品系，再加上该变种或品系的第一个字母，如EcoRⅠ。3.如果一种特殊的寄主菌内有几种不同的限制-修复系统，用罗马字母表示，如EcoRⅠ，EcoRⅤ。4.限制酶前面要带上R（Restriction)，修饰酶前面要带上M（Modification）。(现已省略)三、限制性内切核酸酶的命名P14第一节限制性内切核酸酶若种名头2个字母相同则其中一个可用种名的第一和第三个字母。EcoRⅠEscherichia属名Coli种名Ry13株系编号第一节限制性内切核酸酶(一)识别序列的特异性识别顺序的碱基数一般为4-6bp，少数识别更长，多数识别位点具有旋转对称性（回文结构），少数的识别位点在切割位点之外，具旋转对称性。

4bp

HpaⅠ

C↓CGGGGC↑C

5bp

AvaⅡ

G↓GWCC

CCWG↑G

6bp

SmaⅠ

CCC↓GGGGGG↑CCC

11bp

Bg1Ⅰ

GCCNNNN↓NGGC

CGGN↑NNNNCCG

N=A,T,G,C四、Ⅱ型限制性内切核酸酶的基本特性第一节限制性内切核酸酶1.DNA分子酶切片段的末端Ⅱ型限制性内切核酸酶切割双链DNA，水解磷酸二酯键中3’位酯键产生两个末端，末端结构是5’-P和3’-OH，产生3种不同的切口。(二)切割位点的特异性第一节限制性内切核酸酶（1）5’突出的黏性末端第一节限制性内切核酸酶（2）3’突出的黏性末端第一节限制性内切核酸酶黏性末端：指DNA分子在限制性内切核酸酶的作用下形成的具有互补碱基的单链延伸形成的末端结构，它们能够通过互补碱基间的配对而重新连接起来。P16nicknicks.nicknicks,第一节限制性内切核酸酶（3）平末端

Pst

I5’-CTGCAG-3’5’-CTGCAOH

PG-3’3’-GACGTC-5’3’-GP

HOACGTC-5’EcoRI5’-GAATTC-3’5’-GOH

PAATTC-3’3’-CTTAAG-5’3’-CTTAAP

HOG-5’SmaI5’-CCCGGG-3’5’-CCCOH

PGGG-3’3’-GGGCCC-5’3’-GGGP

OHCCC-5’3’-黏性末端5’-黏性末端平末端第一节限制性内切核酸酶第一节限制性内切核酸酶指来源不同但识别相同靶序列的限制性内切核酸酶。

SstⅠCCGC↓GGSacⅠCCGC↓GG

KpnⅠGGTAC↓CAsp718G↓GTACC

区分：同切点酶或同裂酶、原型酶、新裂酶2.同切点酶(isoschizomer,同裂酶)P17新裂酶第一节限制性内切核酸酶指来源各异，识别的靶序列也各不相同，但切割后能产生相同黏性末端的限制性内切核酸酶。P17一组同尾酶：BamHⅠ(G↓GATCC)、BclⅠ(T↓GATCA)、BglⅡ(A↓GATCT)、Sau3AⅠ(↓GATC)和XhoⅡ(R↓GATCY)同尾酶产生的DNA片段能通过粘性末端之间的互补作用而彼此连接起来，这在分子克隆中很有用。重组后形成的序列一般不能被原来的任何一种同尾酶所识别。3.同尾酶(

isocaudamer)第一节限制性内切核酸酶1U核酸内切酶的酶活性：在最适反应条件和温度下，保温1h，使1μgDNA完全降解所需的酶量。大部分Ⅱ型限制性核酸内切酶需要相似反应条件：

Tris-HCl50mmol/LpH7.5

MgCl210mmol/L

NaCl0-150mmol/LDTT(二硫苏糖醇)1mmol/L

Volume20-100μL

Temperature37℃

Time1-1.5h

五、Ⅱ型限制性内切核酸酶的反应条件0-50mM

低盐酶100

mM

中盐酶150

mM

高盐酶Buffer第一节限制性内切核酸酶在灭菌的0.5mL离心管中进行限制性酶切反应：20μL体积反应体系，加样如下：DNA0.2-1μg10×酶切buffer2.0μL限制性内切酶1-2U（单位）加ddH2O至20μL多种酶消化时若缓冲液条件相同，可同时加入；否则，先做低温或低盐的酶消化，再做高温或高盐的酶消化；或者先一种酶切，然后更换缓冲液，另一种酶再切；又或者使用适合所有限制酶的通用缓冲液。

双酶切反应通用缓冲液使用表第一节限制性内切核酸酶酶切反应的终止EDTA(终浓度10mmol/L)或SDS[终浓度0.1%(W/V)]；65℃温育20min；酚/氯仿抽提，乙醇沉淀。酶解结果鉴定琼脂糖电泳限制酶与识别序列的结合模式GAATTCCTTAAG第一节限制性内切核酸酶完全消化：内切酶在DNA上的所有识别位点都被切开。局部消化：只有有限数量的酶切位点被切开。通过缩短保温时间、降低反应温度或减少酶的用量可达到局部消化的目的。酶切的注意事项：浓缩的限制酶可在使用前以1×限制酶缓冲液稀释。购买的限制酶多保存于50%甘油中，在-20℃是稳定的。进行酶切消化时，将除酶以外的所有反应成分加入后即混匀，再从-20℃冰箱中取出酶，立即放置于冰上。每次取酶时都应更换一个无菌吸头，以免酶被污染。加酶的操作尽可能快，用完后立即将酶放回-20℃冰箱。尽量减少反应体积，但要确保酶体积不超过反应总体积的10%，否则酶活性将受到甘油的抑制。通常延长时间可使所需的酶量减少，在切割大量DNA时可用。注意星号酶切活力。第一节限制性内切核酸酶第一节限制性内切核酸酶(一)酶的纯度(二)DNA样品的纯度DNA样中混有蛋白质、苯酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、NaCl等都有可能抑制酶活性。可采用以下方法提高酶活性：加大酶的用量，1μgDNA用10U酶加大反应总体积延长反应时间添加阳离子亚精胺

六、影响限制性内切核酸酶活性的因素第一节限制性内切核酸酶(三)DNA样品的甲基化程度E.coli中的dam甲基化酶在5’GATC3’序列中的腺嘌呤N6位引入甲基，受其影响的酶有BclⅠ、MboⅠ等，但BamHⅠ、BglⅡ、Sau3AⅠ不受影响。E.coli中的dcm甲基化酶在5’CCAGG3’或5’CCTGG3’序列中的胞嘧啶C5位上引入甲基，受其影响的酶有EcoRⅡ等，但BglⅠ、KpnⅠ不受影响。采用去甲基化酶或甲基化酶缺失的E.coli菌株来制备质粒DNA，可防止DNA的甲基化。第一节限制性内切核酸酶(四)酶切反应的温度与时间大多数限制酶最适反应温度是37℃酶解时间可通过加大酶量而缩短，反之酶量较少时，可通过延长酶解时间以达到完全酶解DNA的目的。(五)DNA的分子构型某些酶切割超螺旋质粒DNA时，酶量比切割线性DNA时高出多倍，可高达20倍。酶最适温度℃

酶最适温度℃

酶最适温度℃

ApaⅠBclⅠMaeⅡTaqⅠ

30505065ApyⅠBstEⅡMaeⅢ

306055BanⅠMaeⅠSmaⅠ

504525第一节限制性内切核酸酶(六)限制酶的反应缓冲液大多数限制酶所需的pH为7.0-7.6。商品化的限制酶一般都带有专用缓冲液。(七)酶的星号活性(staractivity)限制酶的识别和切割特异性是在特定的条件下测定的，当条件改变时，许多酶的识别位点会改变，导致识别与切割序列的非特异性，这种现象称为星号活性。P19例如当EcoRⅠ在pH>8、盐离子浓度<50mmol/L和甘油浓度>5%时，其识别序列由5’G↓AATTC3’变成5’N↓AATTN3’，特异性明显降低，以EcoRⅠ*表示这种活性。第一节限制性内切核酸酶导致星号活性发生的因素高甘油含量(>5%，V/V)；限制酶用量过大(>100U/μgDNA)；低离子强度(<25mmol/L)；高pH(>pH8.0)；含有机溶剂(如二甲基亚砜、乙醇、二甲基乙酰胺等)；Mn2+、Cu2+、Co2+、Zn2+等非Mg2+的二价阳离子存在。

不同的限制酶出现的星号活性的阈值也不一样，常易发生星号活性的酶有：EcoRⅠ、HindⅢ、KpnⅠ、PstⅠ、ScaⅠ、SalⅠ、HinfⅠ等。第一节限制性内切核酸酶抑制星号活性的方法尽量用较少的酶进行完全消化反应，这样可以避免过度消化以及过高的甘油浓度；尽量避免有机溶剂(如制备DNA时引入的乙醇)的污染；将离子浓度提高到100-150mM(若酶活性不受离子强度影响)

；将反应缓冲液的pH值降到7.0

；二价离子用Mg2+。

第一节限制性内切核酸酶重组DNA前的切割构建新质粒构建物理图谱DNA分子杂交用限制性内切酶消化受体DNA制备DNA探针亚克隆以用作序列分析基因定位，DNA同源性研究七、限制性内切核酸酶的应用第二节DNA连接酶(DNALigase)剪刀—限制性内切酶针线、胶水—连接酶第二节DNA连接酶DNA连接酶第二节DNA连接酶DNA连接酶是一种能够催化双链DNA上彼此相邻的3’-羟基(-OH)和5’-磷酸基团(-P)，在NAD+或ATP供能的作用下，形成磷酸二酯键。E.coli和其他细菌的DNA连接酶以NAD+作为能量来源，动物细胞和噬菌体的连接酶则以ATP作为能量来源。一、DNA连接酶的发现第二节DNA连接酶是由T4噬菌体基因30编码的多肽单体；催化过程需要ATP供能；可连接DNA-DNA、DNA-RNA、RNA-RNA和双链DNA的黏性末端或平末端。抑制剂：PO43->5mM，NaCl>25mM，Ca2+>0.1mM二、DNA连接酶的特点1.T4DNA连接酶P21第二节DNA连接酶是由E.coli基因lig编码的一条多肽链；可被胰蛋白酶水解；催化过程需要NAD+供能；能连接具黏性末端的DNA分子，也能连接双链DNA的平末端，不能将DNA-RNA连接。2.大肠杆菌DNA连接酶P22第二节DNA连接酶从耐热菌中克隆到的DNA连接酶基因可在E.coli中高水平表达；以NAD+为辅助因子，并优先作用于缺口；若存在聚合剂，即使是高温，也能催化平末端的连接。3.热稳定DNA连接酶P22连接酶底物辅助因子巯基试剂粘性末端平末端DNA-RNA杂合体RNA-RNA杂合体大肠杆菌DNA连接酶可行可行不行不行NAD+Mg2+不需要T4DNA连接酶可行可行可行可行ATPMg2+需DTT噬热菌DNA连接酶可行不行不行不行NAD+Mg2+需要DNA连接酶的部分性质第二节DNA连接酶DNA连接酶催化的连接反应特点P22连接反应发生在一条DNA链的3’-OH端和另一条DNA链的5’-P端之间；连接反应需要ATP或NAD+和Mg2+作为辅助因子与激活因子；DNA连接酶不能催化两单链DNA分子或环化单链DNA分子的连接；只能连接双链DNA分子的单链缺口(nick)，不能连接双链中一个或多个核苷酸缺失所致的裂口(gap)。注意：缺口（或称切口）和裂口的区别！！！！！缺口(nick)：即双链DNA分子的单链断裂，即在相邻的2个核苷酸分子之间，失去了(移走了)一个磷酸二酯键。裂口(gap)：即DNA裂口，是指双链DNA分子上的某一条链失去一个或数个核苷酸时所出现的DNA单链断裂。第二节DNA连接酶DNA连接酶对不同DNA分子的连接作用第二节DNA连接酶第二节DNA连接酶三、DNA连接酶的作用机理P22第二节DNA连接酶四、DNA连接酶的反应体系

10×T4DNALigaseBuffer1μL

pKRX-T（30ng/μL） 1μL已纯化的PCR产物 XμL*T4DNALigase 2~3WeissUnitsddH2O 至10μL五、影响连接反应的因素反应温度：黏性末端一般为4-15℃，平末端为10-20℃。连接酶浓度：平末端连接的最适酶量约为1-2个Weiss单位(P24)，而黏性末端在同样条件只要0.1个单位，连接时间为16℃、4h或4℃过夜。ATP浓度：最适终浓度一般为0.5mmol/L。DNA片段末端：插入片段与载体的浓度比例为10-20，增加插入片段与载体的接触机会，减少载体自我连接的现象。第二节DNA连接酶分子间的不同连接产物分子内连接第三节DNA聚合酶和反转录酶一、DNA聚合酶(DNApolymerase)是指在引物和模板的存在下，将dNTP连续地加到双链DNA分子引物链的3’-OH末端，催化核苷酸聚合作用的酶。P25类型：依赖于DNA的DNA聚合酶和依赖于RNA的DNA聚合酶。第三节DNA聚合酶和反转录酶DNA聚合酶3’5’外切酶活性5’3’外切酶活性聚合速率持续能力大肠杆菌DNA聚合酶低有中低Klenowfragment低无中低T4DNA聚合酶高无中低T7DNA聚合酶高无快高化学修饰T7DNA聚合酶低无快高遗传修饰T7DNA聚合酶无无快高逆转录酶无无低中TaqDNA聚合酶无有快高E.coli3种类型的DNA聚合酶：DNA聚合酶Ⅰ(DNAPolⅠ)、DNA聚合酶Ⅱ(DNAPolⅡ)、DNA聚合酶Ⅲ(DNAPolⅢ)DNA聚合酶Ⅰ是A.Kornberg等于1956年首次在E.coli

中发现的，它是由polA基因编码的一种单链多肽蛋白质。(一)大肠杆菌DNA聚合酶ⅠP25-26第三节DNA聚合酶和反转录酶CCG3’GGCTATCGG5’E.coli

DNApolIMg2+，dNTPCCGATAGCCGGCTATCGG1.5’→3’聚合酶活性GATAGCCAGCTATCGGTCGATAGCCAGCTATCGGE.coli

DNApolIMg2++pC，pT5’TCGATAGCCAGCTATE.coli

DNApolIMg2+TCGATAAGCTAT+pC，pG，pC5’2.5’→3’外切酶活性

3.3’→5’外切酶活性

DNA聚合酶Ⅰ的三种活性第三节DNA聚合酶和反转录酶DNA聚合酶Ⅰ的用途补齐5’-突起端合成第二条cDNA除去3’-端突起的单链DNA（在无dNTP时）切口移位制备探针第三节DNA聚合酶和反转录酶E.coli

DNA聚合酶Ⅰ被蛋白酶切割成两个大小不同的片段，其中小片段具5’→3’外切酶活性，大片段具5’→3’聚合酶活性和3’→5’外切酶活性，称为E.coli

DNA聚合酶Ⅰ大片段或Klenow片段。(二)Klenow片段P27第三节DNA聚合酶和反转录酶Klenow片段的主要用途取代polⅠ进行3’端补平：补平经限制性内切酶切后形成的3’凹陷末端；DNA3’末端标记：在3’凹陷末端加上32P放射性标记的dNTP；双脱氧末端终止法进行DNA序列分析。第三节DNA聚合酶和反转录酶5’

klenow5’

cDNA第二链的合成合成杂交探针和进行体外突变：在单链模板上延伸寡核苷酸引物。第三节DNA聚合酶和反转录酶mRNAcDNA第一链逆转录cDNA第二链klenow5’3’3’

5’

5’

3’

引物具5’→3’的DNA聚合酶活性及很强的3’→5’核酸外切酶活性（降解单链更快）。在无dNTP时，可以从任何3’-OH端外切在只有一种dNTP时，外切至互补核苷酸在四种dNTP均存在时，聚合活性占主导地位(三)T4DNA聚合酶P27-28第三节DNA聚合酶和反转录酶T4DNA聚合酶的主要用途补平或标记DNA分子经限制性内切酶消化后形成的3’凹端；对带有3’突出末端或平末端的DNA片段进行标记，制备特异性探针；利用T4DNA聚合酶强的3’-5’外切酶活性，将双链DNA3’突出末端转化为平末端。第三节DNA聚合酶和反转录酶从T7噬菌体感染的E.coli细胞中纯化出来的，由两个亚基组成：①T7基因5编码的大亚基：有5’3’聚合酶和3’5’外切酶活性。②E.coli基因编码的小亚基：硫氧还蛋白，增加大亚基对模板的亲和性。是所有已知DNA聚合酶中持续结合能力最强的一个，主要用于催化大分子模板的引物延伸反应。测序酶：通过化学修饰或基因工程方法对T7DNA聚合酶进行改造，去除其3’5’外切酶活性，保留其聚合酶活性。(四)T7DNA聚合酶P28第三节DNA聚合酶和反转录酶来源：从耐热细胞中纯化，已有基因工程酶多种。结构：单亚基，相对分子量为94000。特点：热稳定性，70℃反应2h残留活性为原来的90%；93℃反应2h残留活性为原来的60%；94℃反应2h残留活性为原来的40%。活性：聚合最适温度为75-80℃，不具3’→5’外切酶活性，具5’→3’聚合酶活性和5’→3’外切酶活性。用途：PCR反应；测序，高温下进行DNA合成可减少模板二级结构。(五)TaqDNA聚合酶P28第三节DNA聚合酶和反转录酶第三节DNA聚合酶和反转录酶二、反转录酶(reversetranscriptase)依赖RNA的DNA聚合酶(RNA指导的DNA聚合酶)来源：来自禽类成髓细胞瘤病毒(AMV)(42℃,pH8.3)。来自Moloney鼠白血病毒(M-MLV)(37℃,pH7.6)。结构和活性：酶类别肽链5’-3’聚合活性RNAseHAMVα64,

000β96,000++++M-MLV71,000++第三节DNA聚合酶和反转录酶用途：P29以mRNA为模板合成其互补的DNA(cDNA)，用于构建cDNA和基因克隆；对具5’端突出的DNA片段的3’凹端进行补平和标记，制备杂交探针；代替Klenow片段或测序酶，用于DNA序列分析。cDNA合成的主要步骤：在某种生物的mRNA分子中，加入引物使之与mRNA退火，并引导反转录酶按照mRNA模板合成第一链cDNA，产物是mRNA:DNA杂交分子；然后再以cDNA第一链为模板合成双链cDNA。第三节DNA聚合酶和反转录酶RNaseH活性第四节DNA修饰酶一、末端脱氧核苷酸转移酶(terminaldeoxynucleotidyl

transferase,TdT)简称末端转移酶，能催化5’→3’方向的聚合作用，逐个地将dNTP加到DNA分子的3’-OH末端。特点：不需要模板无前体物特异性（同聚物加尾）反应需要二价阳离子参与第四节DNA修饰酶3’突出末端末端转移酶功能图解3’凹陷末端第四节DNA修饰酶用途：P30用于克隆DNA片段，给载体和外源DNA3’末端分别加上互补的同聚物尾巴，以便二者在体外连接。用于DNA片段3’末端标记，催化[α-32P]-3’-脱氧核苷酸标记DNA片断的3’末端；催化生物素等非放射性的标记物掺入到DNA片断的3’-末端。按照模板合成多聚核糖核苷同聚物。第四节DNA修饰酶二、T4多核苷酸激酶(T4polynucleotidekinase)由T4噬菌体的pseT基因编码，能催化-磷酸基从ATP转移给单链或双链DNA或RNA的5’-OH端。P30常用于两种反应：正向反应和交换反应。用途：DNA5’端磷酸化标记DNA或RNA的5’端5’3’3’5’3’HO--OHHO--OH3’P--OH5’HO--P5’pppATP(-32P的ATP)T4多核苷酸激酶第四节DNA修饰酶三、碱性磷酸酶(alkalinephosphatase)能催化核酸分子脱掉5’的磷酸基团从而使DNA或RNA片段的5’-P端转换成5’-OH端。P31来源和性质：来自大肠杆菌的细菌碱性磷酸酶(BAP)，耐高温；来自小牛肠的小牛肠碱性磷酸酶(CIP)，70℃加热10min可完全失活。3’

HO--P5’

3’

HO--OH5’

3’

HO--OH碱性磷酸酶5’

P--OH3’

5’

第四节DNA修饰酶用途：DNA或RNA分子片段5’末端的去磷酸化，防止自身连接；在5’端标记之前，去除DNA或RNA分子的5’末端磷酸基团。P31-32其中每条链上都有一个nick，但转入细菌后会被修复。第五节外切核酸酶(Exonuclease)是一类从多核苷酸链的末端开始逐个降解核苷酸的酶。类型：P32作用于单链的外切核酸酶，如E.coli外切核酸酶Ⅰ(exoⅠ)、E.coli外切核酸酶Ⅶ(exoⅦ)；作用于双链的外切核酸酶，E.coli外切核酸酶Ⅲ(exoⅢ)、噬菌体外切核酸酶(

exo)、T7噬菌体基因6外切核酸酶；既可作用于单链又可作用于双链的外切核酸酶，如Bal31核酸酶。第五节外切核酸酶底物核酸酶外切起点识别位点切割产物单链DNAE.coli外切核酸酶Ⅰ(exoⅠ)5’3’5’-OH5’-单核苷酸E.coli外切核酸酶Ⅶ(exoⅦ)5’3’3’5’5’-P3’-OH2-25bp寡核苷酸片段双链DNAE.coli外切核酸酶Ⅲ(exoⅢ)3’5’3’-OH5’-单核苷酸噬菌体外切核酸酶(

exo)5’3’5’-P5’-单核苷酸T7噬菌体基因6外切核酸酶5’3’5’-P5’-OH5’-单核苷酸单、双链DNABal31核酸酶：双链外切、单链内切活性5’3’3’5’3’-OH5’-单核苷酸，缩短的dsDNA不同外切核酸酶的特性比较第六节单链内切核酸酶来源：来源于米曲霉菌，由nucO编码，已被克隆。功能：是一种高度特异的单链内切核酸酶，需要Zn2+、高离子强度和酸性条件；降解ssDNA的速度比降解ssRNA快7倍。一、S1核酸酶P34第六节单链内切核酸酶注意：S1核酸酶酶量过大时，伴有双链核酸的降解，但降解速度仅为单链的1/75000。第六节单链内切核酸酶用途：切掉DNA片段的单链突出末端；在双链cDNA合成中切除发夹环结构；第六节单链内切核酸酶S1核酸酶作图法确定真核基因中内含子的位置、RNA分子定位等。第六节单链内切核酸酶对单链DNA具有特异的内切酶活性，可从3’-OH末端迅速降解DNA；

对线性dsDNA，具有3’5’外切酶活性和5’3’外切酶活性，产生5’-单核苷酸和缩短的dsDNA；外切酶活性远远大于内切酶活性。二、Bal31核酸酶P34-35第六节单链内切核酸酶用途：绘制限制酶谱，DNA定序，构建缺失突变体等。第六节单链内切核酸酶简称DNA酶Ⅰ(DNaseⅠ)，是来源于牛胰脏的糖蛋白；能从嘧啶核苷酸5’磷酸基处随机降解