乙肝表面抗原ELISA法定量分析方法学验证

乙肝表面抗原的ELISA法定量解析方法学考据大纲目的：对福州宏图生物工程有限公司生产的HBsAg的ELISA法定量解析试剂盒进行方法学考据，以判断可否能用于临床样本解析。方法：ELISA法定量解析，应用试剂盒HBsAg标准品从浓度为8ng/ml做2倍稀释的6个浓度梯度做标准曲线，以6，3，个浓度梯度5复孔做正确度，精美度和检测限等方法学考据。结果：标准曲线，正确度97.07%的RSD为16.78%，不满足ng/ml级水平的RSD一般应<15%的要求，检测限LOD为，低浓度样品（）的检测在正确性和精美度方面都低于高浓度样品，不适合低浓度样品的检测。结论：该HBsAg的ELISA法定量解析试剂盒不能够用于临床标本的解析。要点词：乙肝表面抗原ELISA定量解析方法学考据、八 、■前言乙肝病毒感染是我国最常有的感染性疾病之一，而乙型肝炎血清标志物是检测乙肝病毒感染最主要的病原标志。随着免疫学技术的不断发展，抗原抗体检测矫捷度明显提高，使低水平乙肝病毒得以检出，对临床诊断及流行病学有重要意义 [1]。ELISA法拥有较高灵敏度、特异性强、重复性好、可进行定量和半定量测定等优点，能够在酶免疫解析仪上做批量检测。目前临床上多倾向于做定量解析，若想知道检验结果可否可靠，实验室则必定对所用试剂盒进行方法学考据，本实验对福州宏图生物工程有限公司生产的 HBsAg的ELISA法定量解析试剂盒进行正确度，精美度和检测限等方法学考据，现报告以下。1.资料与方法试剂盒乙肝表面抗原ELISA法定量解析试剂盒，福州宏图生物工程有限公司出品。仪器酶标仪：Bio-Rad680；洗板机：Bio-Rad1575；超纯水系统：MilliporeElix；电热恒温培养箱(DNP-9052)上海精宏实验设备有限公司；振荡器(苏州管械， KJ-201A)；移液器；Tip头；EP管。方法1.3.1．溶液配置1XPBS缓冲液的配置： 称取8gNaCl、0.2gKC1、Na2HPO4和0.24gKH2PO4，溶于800ml蒸馏水中，用HCl调治溶液的pH值至7.4，最后加蒸馏水定容至1L即可。标准品的配置：原始标准品浓度为8ng/ml。。取6个2mlEP管，分别标志为S1-S6。50ul/well,共1孔需50ul，每孔配置60ul备用，依据下表稀释方案进行稀释。表1标准品的稀释方案质控品的配置：50ul/well,共5复孔需250ul，配置300ul备用，取3个2mlEP管，分别标志为C1,C2,C3，依据下表稀释方案进行稀释。表2质控品的稀释方案1.3.2．铺板方案取出试剂盒中已包被酶标板，取出板条，依据下表铺板方案进行铺板在相应孔中依次加入系列标准品、质控品及空白比较，每孔50ul。空白比较加入1XPBS缓冲液。表3铺板方案1.3.3．加样步骤加入酶标抗体，50ul/well ，震荡。37°C电热恒温培养箱温育60min，取出后洗板4次，加入A、B液,50ul/well，37C电热恒温培养箱温育15min。加入停止液，50ul/well。酶标板放入酶标仪，盖上盖子，在电脑上打开 软件，选择450nm波长(参照波长630nm)，设置LAYOUT和报告模式，测定各孔吸取值。2.结果标准曲线与线性范围标准品理论浓度对应的实测OD值表4实测OD值以HBsAg理论浓度为横坐标，所测OD值为纵坐标作图，绘制标准曲线观察线性关系，结果显示，显示拥有优异的相关性Absorbance(OD)Conc(ng/ml)图1线性关系图正确度(回收率)的考据质控品理论稀释浓度对应实测浓度值表5实测浓度值质控品做了3个浓度梯度，每个浓度做了5个复孔，下表是对每个浓度梯度进行正确度(回收率)的考据。表6正确度的考据结果显示HBsAg6ng/ml和3ng/ml的平均回收率为97.58%，113.07%，满足限度要求在85%-115%的范围内，而的平均回收率为80.56%，满足方法定量限在80%-120%的范围内3个浓度梯度的平均回收率为97.7%，显示正确性好。2.3精美度的考据板内精美度的考据上表中RSD(%)这一参数表示相对标准误差，也就是变异系数 CV值，HBsAg6ng/ml的5个复孔的变异系数CV值为12.73%，显示孔间差异较大，精美度不高，但是也吻合ng/ml级RSD水平的一般应<15%的要求，其中有一孔浓度为4.55，与其他孔比较差异较大，可能是由于操作引起比方加样严禁。而3ng/ml,和的变异系数CV为3.5%，3.7%，吻合显示孔间重复性好，吻合ng/ml级RSD水平的一般应<15%的要求，精美度高。板间精美度的考据从同一实验室中获得2组同样的数据，做板间精美度的考据。第一对同一实验条件下不同样实验人员所获得的数据可否可用于板间解析做考据。表8板间精美度的考据以HBsAg理论浓度为横坐标，所测OD值为纵坐标作图，绘制标准曲线观察线性关系。Absorbance(OD)Conc(ng/ml)图2线性关系曲线以上标准曲线结果显示第二组数据的R2=0.967，第三组数据R2=0.991。第二组数据由于有一些孔与标准曲线偏离较大，但考虑到随机抽样与均数存在必然误差，还是能够用于统计学解析。下表对3组数据做板间解析。从表中3个组的数据比较可知，HBsAg6ng/ml和3ng/ml的RSD分别为9.10%，12.06%满足对ng/ml级水平的RSD一般应<15%的要求，精美度高。而的RSD为16.78%，不满足ng/ml级水平的RSD一般应<15%的要求，显示低浓度的孔间重复性差，精美度不是很高，故以下对HBsAg理论浓度为的三组数据做解析。对HBsAg理论浓度为的正确性，精美度解析表9精美度解析从上表可知第一组数据和第三组数据正确性差，精美度高。而第二组数据正确性高，而精美度有对于第一组和第三组数据要好。综上对于HBsAg理论浓度为的这一低浓度梯度的板内正确性和板间精美度有对于高浓度的线性要差一些。检测限（LOD）计算LOD为取空白孔的OD值的均数加2倍标准差。表10空白孔的OD值由上表可知，LOD为0.172。检测限（LOD）表示解析方法检测低浓度样品的能力，也称为方法的矫捷度，LOD平时为标准曲线上的最低浓度点，要求标准曲线上的最低浓度点应>LOD，此标准曲线上最低浓度点为0.25，大于LOD（0.172），故此标准曲线线性好。3.谈论乙肝表面抗原定量解析的意义乙肝表面抗原是乙肝两对半的其中一项，乙肝两对半定性检测对乙肝疾病的诊断，病情监测，疗效观察起到了必然的作用。但随着临床医学的发展，乙肝两对半定性检测已经远远不能够满足临床及患者的要求，特别是在疗效观察以及乙肝疫苗注射后抗体产生情况的观察上有明显的不足。随着检验医学的发展，乙肝两对半定量测定成为可行，大大填充了乙肝两对半定性检测的不足。而且乙肝两对半定量检测可与HBVDNA荧光测定相互补充，综合谈论患者病情与药物疗效，为低含量的慢性乙肝、病毒携带者供应了正确判断病情的依据。这在目前的临床治疗中应用十分宽泛。常用定量解析方法此次实验可是对一种试剂盒的可用性进行方法学考据，而目前常用的定量方法已有很多，如TRFIA，TRFIA法又称解离增强镧系荧光免疫解析，是近十年发展起来的一种微量解析方法。此技术集酶标志、同位素标志技术的优点于一身，拥有矫捷度高、特异性强、稳定性好，且测定范围更宽，试剂盒货架寿命长，操作简略和非放射性等特点，成为最有潜力的一种标志免疫解析方法【3】。全自动酶免解析仪目前也宽泛应有，自动化、标准化的操作手段使实验达到了全过程控制和全过程标准化解析，大大提高了实验的精美度【4】，使检测结果更趋牢固，从而保证了实验结果的可靠性。方法归纳目前宽泛使用的HBsAg试剂尽管在制备时采用了高亲和力的单克隆抗体，而且使包被

抗体、酶标抗体的结合位点尽可能的远。以防备竞争控制，最大程度地解决钩状效应（HOOK）的问题【5】。本次实验是对实验室的一种试剂盒，即福州宏图生物工程有限公司生产的HBsAg的ELISA法定量解析试剂盒进行方法学考据，以判断可否能用于临床样本解析。试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验。往起初包被 HBsAg捕获抗体的包被微孔中，依次加入标本，标准品，HRP标志的检测抗体，经过温育并完整冲洗。用底物TMB显色，TMB在过氧化物的催化下转变成蓝色，并在酸的作用下最后转变为黄色。颜色的深浅和样品中得HBsaAg呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度OD值，计算样品浓度。应用试剂盒HBsAg标准品从浓度为8，4，2，1,0.5，个浓度梯度做标准曲线，以6，3，个浓度梯度5复孔做质控，进行正确度，精美度和检测限等方法学考据。选择最低浓度为的原因是由于，绝大多数HBV感染者外周血中可出现HBsAg，含量在5ng/ml〜600ug/ml之间，高者可达2000ug／ml以上【6】，满足了现阶段文件报道的最低浓度值。方法学考据内容方法学考据内容一般包括标准曲线，正确度，精美度和检测限。标准曲线亦称校正曲线，系指生物样品中所测定的样品浓度与响应的相关性，平时用回归解析方法所得的回归方程来评件，此实验所用了6个浓度点建立标准曲线。方法正确度指待测浓度与真实浓度的凑近值了，一般用相对回收率表示，限度要求在85%—115%的范围内。精美度则表示解析方法的可重复性，是对同同样品每次测定结果的一致性，用标准误差和相对标准误差表示，可做板内和板间的考据，对于ug/ml级水平的相对标准误差一般应<10%,ng/ml级水平的相对标准误差一般应<15%。检测限则表示解析低浓度样品的能力，平时又称为矫捷度。结果解析及应用谈论第一组数据标准曲线，显示拥有优异的相关性，HBsAg浓度为6ng/ml和3ng/ml的回收率分别为为97.58%，吻合113.07%，吻合限度要求在85%—115%的范围内。但是HBsAg浓度为.5ng/ml的回收率为80.56%，显示此试剂盒对于低浓度样品的检测正确度差。在精美度方面，6，3，变异系数CV分别为12.73%，3.69%，3.50%，而HBsAg6ng/ml的5个复孔的变异系数CV值为12.73%，显示孔间差异较大，精美度不高，但是也吻合ng/ml级RSD水平的一般应<15%的要求，其中有一孔浓度为4.55，与其他孔比较差异较大，可能是由于操作引起比方加样严禁不属于试剂盒的问题，故能够认为此试剂盒对于批内高、低浓度样品的检测精美度还是能够的。在做3个组数据的批间的精美度解析时，发现6，3，变异系数CV分别9.10%，12.06%，16.78%，分布方式从低到高，前2个浓度满足对ng/ml级水平的RSD一般应<15%的要求。的RSD为16.78%，不满足ng/ml级水平的RSD一般应<15%的要求，显示低浓度的孔间重复性差，精美度不是很高。综上解析，该试剂盒对于高浓度样品的检测拥有优异的正确性和较高的精美度，而对于低浓度样品()的检测在正确性和精美度方面都低于高浓度样品，不适合低浓度样品的检测。目前绝大多数HBV感染者外周血HBsAg浓度很低，该试剂盒不能够全面检测出此类人群，故该试剂盒不能够用于临床标本的检测。参照文件参照文件【1】魏来，陶其敏．努力规范肝脏疾病的免疫学诊断．中华检验杂志， 2003，26：69—71【2】刘晓梅，张世兰．HBsAg阴性结果的慢性乙型肝炎患者病毒血症水平与临床的关系[J】．临床检验杂志，2004，22(5)：381-382．

【3】李辉霞，王德志，杨朋，乙肝两对半定量检测及临床意义，医学信息杂志23(9)。【4】WeberB,DenglerT,BergerA.Evaluationoftw