ch05稠环芳烃的高效液相色谱法分析

实验五

稠环芳烃的高效液相色谱法分析及柱效能评价实验讲解要点一、高效液相色谱法特点和优点二、高效液相色谱法按分离机制分类三、反相色谱法及分离原理四、HPLC和GC法的比较五、高效液相色谱仪的基本组成与作用六、高效液相色谱的定性与定量七、使用高效液相色谱仪注意事项八、实验部分

HPLC有以下特点：

高压-压力可达150~300Kg/cm2。

高速-流速为0.1~10.0ml/min。

高效-可达5000塔板每米。在一根柱中同时分离成份可达100种。

高灵敏度-紫外检测器灵敏度可达0.01ng。同时消耗样品少。HPLC与经典液相色谱相比有以下优点：速度快-通常分析一个样品在15~30min，有些样品甚至在5min内即可完成。分辨率高-可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果。灵敏度高-紫外检测器可达0.01ng，荧光和电化学检测器可达0.1pg。柱子可反复使用-用一根色谱柱可分离不同的化合物。样品量少，容易回收-样品经过色谱柱后不被破坏，可以收集单一组分或做制备。

一、HPLC的特点和优点二、高效液相色谱法按分离机制的不同分为：液固吸附色谱法

液液分配色谱法（正相与反相）离子交换色谱法离子对色谱法分子排阻色谱法液液色谱法现在多采用的是化学键合固定相，如C18、C8、氨基柱、氰基柱和苯基柱。液液色谱法按固定相和流动相的极性不同可分为正相色谱法(NPC)和反相色谱法(RPC)。

四、反相色谱法及分离原理

正相色谱法采用固定相为极性的，流动相为相对非极性的疏水性溶剂反相色谱法及分离原理一般用非极性的十八烷基键合相（ODS）为固定相，极性的水或缓冲液中加入甲醇、乙腈、丙酮等有机溶剂（有机溶剂以调节保留时间）为流动相，在反相色谱法分离中极性大的化合物先留出，碳原子数少的样品先流出。适用于分离非极性和极性较弱的化合物。反相色谱法在现代液相色谱中占整个HPLC应用的80%左右。高效液相色谱与气相色谱峰异同点

HPLC

流动相：液体液体粘度大，扩散系数小流动相可广泛选择，并可配成多元体系，因此分辨率高高效液相色谱采用5～10um细颗粒固定相，流动相通透性小，必须用高压输送。应用更广，有机物75～85%可采用

高效液相色谱法进行分离。适应于高沸点难挥发，热稳定性差的物质高灵敏度，可检测ng/ml样品。

GC流动相：载气气体粘度小，扩散系数大，流动相选择余地小不用高压泵输送只有25%只有有机物能用GC进行分离适应于易挥发、较低沸点，热稳定性好的物质灵敏度高，可检测ng/ml样品高效液相色谱仪的基本组成一、高压输送系统二、进样系统三、分离系统四、检测系统五、数据处理系统色谱柱恒温器连接管高效液相色谱仪结构

色谱软件，HPLC输出接口与色谱系统联用检测器进样口注射器进样阀溶液储存器高压输液泵梯度洗脱系统高压输液系统进样系统分离系统检测系统数据处理系统

高效液相色谱流程示意图一、高压输送系统二、进样系统三、分离系统四、检测系统五、数据处理系统高压泵工作原理（单向阀）六通阀工作原理（流路切换）六通阀工作原理（流路切换）高压泵工作原理（单向阀）六通阀工作原理（流路切换）

高效液相色谱的定性与定量定性的方法：采用保留值定性，在实验条件相同（如温度、流动相比例等）的条件下，将未知物的保留时间与已知纯物质的保留时间对比而进行定性分析定量的方法：采用峰面积的归一化法，内标法(内标校正因子法，内标工作曲线法和内标对比法)，外标法和（工作曲线法和外标一点法）标准加入法定量。外标法进行定量时不需要考虑校正因子，可根据试样的峰面积(Ai)和已知含量的标样中组分的峰面积(As)，求得样品的含量。XsAiXi(%)=×100%As归一化法所有组分必须在一个分析组分里面均流出色谱柱，但简便，定量结果与进样量无关，操作条件变化对结果影响较小。AifiWi（%）=×100%A1f1+A2f2+…+Anfn六、实验部分色谱实验条件HPLC仪Waters515型Waters2487紫外检测器色谱柱：WatersC18(4.6×250mm,)流动相：CH3OH-H2O(85/15,v/v)流速：1mL/min检测波长：254nm进样体积：20ul1流动相的配制、过滤和除气

2标准曲线制备三组分混标液：每mL溶液分别约含0.5mg苯、萘和联苯。取2μL、5μL、10μL、20μL混标进样，以峰面积对进样量作标曲（要求相关系数大于0.99）。3样品分析:20uL未知样品进样,外标法和归一化法定量实验内容与主要步骤1更换流动相。2开动仪器，让色谱柱平衡。3设置色谱工作站参数。4进样、采集色谱图。1）三组分混标液2）标准溶液系列3）未知样品5色谱数据分析，打印色谱图及分析报告。6更换甲醇流动相，清洗色谱柱。7关闭仪器。数据及处理1、记录实验条件：色谱柱与固定相，流动相与流量，进样量2、测量各色谱峰中苯、萘、联苯等的保留时间tR及相应色谱峰宽W,计算各对应的理论塔板数n、分离度R等（也可用软件直接操作）3、将不同含量混标液为横坐标，对应的峰面积为纵坐标作图求标准曲线方程，测定未知样品的峰面积代入标准曲线方程，求样品的浓度。4、用步骤2中一个实验点结果，以苯为基准物，求出其组分的相对校正因子，用归一化法定量计算。使用高效液相色谱仪的注意事项1HPLC的日常操作条件工作温度10～30℃；相对湿度<80％；最好是恒温、恒湿，远离高电干扰、高振动设备。2泵的保养流动相要清洁；进液处过滤头要经常清洗；流动相交换时要防止沉淀；避免泵内堵塞或有气泡。3进样器的保养每次分析结束后，要反复冲洗进样口，防止样品的交叉污染。4柱的保养柱