酵母细胞的固定化兰

专题4酶的研究与应用课题3酵母细胞的固定化在应用酶的过程中，人们发现了一些实际问题：课题背景如今，酶已经大规模地应用于食品、化工、轻纺、医药等各个领域。酶通常对强酸、强碱、高温和有机溶剂等条件非常敏感，容易失活；溶液中的酶很难回收，不能被再次利用，提高了生产成本；反应后酶会混在产物中，可能影响产品质量。

有人设想，将酶固定在不溶于水的载体上，使酶既能与反应物接触，又能与产物分离，同时，固定在载体上的酶还可以被反复利用。现代的固定化酶技术已完全实现了这一设想。

自20世纪70年代，在固定化酶技术的基础上，又发展出了细胞固定化技术。与固定化酶技术相比，固定化细胞制备的成本更低，操作更容易。酶是由细胞合成的，于是，又有人设想，能否将合成酶的细胞直接固定?

阅读P49~50，并思考：1、解决酶应用中存在问题的方法是？2、这种方法的优点是什么？3、什么是高果糖浆？使用它有何好处？4、生产高果糖浆需要什么酶？其作用是什么？这种酶有何特点？5、了解高果糖浆生产过程。一、固定化酶的应用实例1、固定化酶技术：即将酶固定在一定空间内的技术（如固定在不溶于水的载体上）。2、固定化酶技术的优点：（1）使酶既能与反应物接触，又能与产物分离；（2）固定在载体上的没可以被反复利用。3.高果糖浆是果糖含量为42%左右的糖浆。作为蔗糖的替代品，高果糖浆不会像蔗糖那样诱发肥胖、糖尿病、龋齿和心血管病，对人的健康更有益。4.高果糖浆的生产需要使用葡萄糖异构酶，它能将葡萄糖转化成果糖。这种酶的稳定性好，可以持续发挥作用。但是，酶溶解于葡萄糖溶液后，就无法从糖浆中回收，造成很大的浪费。使用固定化酶技术，将这种酶固定在一种颗粒状的载体上，再将这些酶颗粒装到一个反应柱内，柱子底端装上分布着许小孔的筛板。酶颗粒无法通过筛板上的小孔，而反应溶液却可以自由出入。生产过程中，将葡萄糖溶液从反应柱的上端注入，使葡萄糖溶液流过反应柱，与固定化葡萄糖异构酶接触，转化成果糖，从反应柱的下端流出。反应柱能连续使用半年，大大降低了生产成本，提高了果糖的产量和质量。目前，用固定化葡萄糖异构酶生产高果糖浆的规模已经超过了每年1000万吨。

隐藏资料(一)、固定化酶的应用实例5、固定化酶技术生产高果糖浆的图示：注意反应柱的各部分名称。使用固定化酶技术，将葡萄糖异构酶固定在一种颗粒状的载体上，再将这些酶颗粒装到一个反应柱内，柱子底端装上分布着许多小孔的筛板。酶颗粒无法通过筛板上的小孔，而反应液却可以自由出入。生产过程中，将葡萄糖溶液从反应柱的上端注入，使葡萄糖溶液流过反应柱，与固定化葡萄糖异构酶接触转化成果糖，从反应柱的下端流出基础知识

(一)、固定化酶的应用实例5高果糖浆生产过程:含淀粉的浆液α-淀粉酶糊精糖化酶葡萄糖葡萄糖异构酶葡萄糖的异构化42%～45%转化成果糖果葡糖浆果糖和葡萄糖分离葡萄糖再次异构化反复多次果糖含量70%～90%高果糖浆固定化酶技术生产高果糖浆生产流程基础知识

(一)、固定化酶的应用实例（1）使酶既能与反应物接触，又能与产物分离；（2）固定在载体上的酶可以被反复利用。反应柱能连续使用半年，大大降低了生产成本，提高果糖的产量和质量。基础知识

(一)固定化酶的应用实例优点:一种酶只能催化一种化学反应，而在生产实际中很多产物的形成都通过一系列的酶促反应才能进行，所以操作比较麻烦。

可采用固定化细胞技术。缺点：练习、目前，日用化工厂大量生产的酶制剂，其中的酶大都来自A、化学合成B、动物体内C、植物体内D、微生物体内

在生产实际中使用固定化酶技术有无不足?如有不足,怎么办?有。一种酶只能催化一种化学反应，而在生产实际中很多产物的形成都通过一系列的酶促反应才能进行，所以操作比较麻烦。可采用固定化细胞技术。二、固定化细胞技术1、概念：利用物理或化学方法将细胞固定在一定空间的技术。细胞中含有一系列酶，在细胞正常生命活动的过程中，通过代谢产生所需要的代谢产物。阅读P50：思考第二段的问题包埋在网格中用化学键结合起来物理吸附在载体上2、固定化酶或细胞的常用方法酶物理吸附法化学结合法细胞包埋法原因①细胞个大，酶分子很小②个体大的细胞难以被吸附或结合而个小的酶容易从包埋的材料中漏出3.酶和细胞固定方法的选择方法原理适用对象1包埋法2化学结合法3物理吸附法隐藏资料是将聚合物的单体与酶溶液混合，再借助于聚合助进剂(包括交联剂)的作用进行聚合，酶被包埋在聚合物中以达到固定化酶或细胞酶蛋白的侧链基团和载体表面上的功能基团之间形成共价键而固定的方法通过氢键、疏水作用和π电子亲和力等物理作用，将酶固定于水不溶载体上．从而制成固定化酶酶酶4、固定化细胞常用的载体常用的不溶于水的多孔性载体有哪些？明胶、琼脂糖、海藻酸钠、醋酸纤维素、聚丙烯酰胺等

三.实验操作

今天我们以酵母细胞为实验材料，进行酵母细胞的固定化实验。（一）制备固定化酵母细胞阅读P50~51思考下列问题：（1）制备过程包括哪几个步骤？（2）各步骤应当分别注意什么问题？（一）制备固定化酵母细胞的操作步骤1．酵母细胞的活化2．配制物质的量浓度为0.05mol／L的CaCl2溶液3．配制海藻酸钠溶液4．海藻酸钠溶液与酵母细胞混合

5．固定化酵母细胞1、酵母细胞的活化实验操作取1g干酵母，放入50ml的小烧杯中，加入蒸馏水10ml，用玻璃棒搅拌，使酵母细胞混合均匀，成糊状，放置1h左右使其活化。活化：就是让处于休眠状态的微生物重新恢复正常的生活状态注意事项A、选用的干酵母要具有较强的活性，而且物种单一B、在缺水状态下，微生物处于休眠状态。注意水的用量实验操作2、配制物质的量浓度为0.05mol/L的CaCl2溶液称取无水CaCl20.83g。放人200mL的烧杯中，加入150mL的蒸馏水，使其充分溶解，待用。注意事项溶解物质要彻底，勿用自来水溶解，以防自来水中各种离子影响实验结果3、配制海藻酸钠溶液实验操作称取0.7g海藻酸钠，放入50mL小烧杯中，加人10mL水，用酒精灯加热，边加热边搅拌，将海藻酸钠调成糊状，直至完全溶化，用蒸馏水定容至10mL。注意，加热时要用小火，或者间断加热，反复几次，直到海藻酸钠溶化为止。说明：海藻酸钠的浓度涉及到固定化细胞的质量。如果海藻酸钠浓度过高，将很难形成凝胶珠；如果浓度过低，形成的凝胶珠所包埋的酵母细胞的数目少，影响实验效果。4、海藻酸钠溶液与酵母细胞混合将溶化好的海藻酸钠溶液冷却至室温，加入已活化的酵母细胞，进行充分搅拌，使其混合均匀，再转移至注射器中实验操作注意事项

A、溶化好的海藻酸钠溶液必须冷却至室温，否则会因温度过高杀死酵母菌B、搅拌要彻底充分，使两者混合均匀，以免影响实验结果的观察实验操作5、固定化酵母细胞以恒定的速度缓慢地将注射器中的溶液滴加到配制好的CaCl2溶液中，观察液滴在CaCl2溶液中形成凝胶珠的情形。将这些凝胶珠在CaCl2溶液中浸泡30min左右如果没有注射器，可以在小塑料瓶上安装一个孔径为2mm的喷嘴来使用。注意事项A、可利用海藻酸钠制成不含酵母菌的凝胶珠，用作对照B、海藻酸钠胶体在CaCl2这种电解质的作用下，发生聚沉，形成凝胶珠，需稳定30min左右（二）用固定化细胞发酵

1、将固定好的酵母细胞(凝胶珠)用蒸馏水冲洗2-3次。实验操作

2、将150mL质量分数为10%的葡萄糖溶液转移到200mL的锥形瓶中，再加入固定好的酵母细胞，置于25℃下发降24h。注意事项①控制好发酵温度，一般是室温25℃②发酵时间可视具体情况而定，一般时间稍长一些，效果明显③可用不含酵母的凝胶珠做相同的处理，对照实验结果

海藻酸钠在水中溶解的速度较慢，需要通过加热促进其溶解。溶解海藻酸钠，最好采用小火间断加热的方法。例如，加热几分钟后，从石棉网上取下烧杯冷却片刻，并不断搅拌，再将烧杯放回石棉网继续加热，如此重复数次，直至海藻酸钠完全溶化。如果加热太快，海藻酸钠会发生焦糊。四.操作提示五.结果结果分析与评价1制备固定化酵母细胞结果分析

形成凝胶珠的颜色较深，形状为圆形或椭圆形成功

凝胶珠颜色过浅，呈白色失败

原因

固定的酵母细胞过少，海藻酸钠浓度偏低

凝胶珠不是椭圆形或圆形，呈其它形状失败

原因

固定的酵母细胞过多，海藻酸钠浓度偏高2固定化酵母细胞发酵结果分析

葡萄糖溶液中产生许多气泡，同时闻到酒味

注意：

刚形成的凝胶珠应在CaCl2溶液中浸泡一段时间，以便形成稳定的结构。

检验凝胶珠的质量是否合格，可以使用下列方法。一是用镊子夹起一个凝胶珠放在实验桌上用手挤压，如果凝胶珠不容易破裂，没有液体流出，就表明凝胶珠的制作成功。二是在实验桌上用力摔打凝胶珠，如果凝胶珠很容易弹起，也能表明制备的凝胶珠是成功的。类型优点不足直接使用酶固定化酶固定化细胞直接使用酶、固定化酶和固定化细胞催化的优缺点P52

一种酶只能催化一种化学反应，而在生产实践中，很多产物的形成都通过一系列的酶促反应才能得到的对环境条件非常敏感，容易失活；溶液中的酶很难回收，不能被再次利用，提高了生产成本；反应后酶会混在产物中，可能影响产品质量固定后的酶或细胞与反应物不容易接近，可能导致反应效果下降等。由于大分子物质难以自由通过细胞膜，因此固定化细胞的应用也受到限制催化效率高，低耗能、低污染等酶既能与反应物接触，又能与产物分离，同时，固定在载体上的酶还可以被反复利用成本低、操作容易。对酶活性的影响更小、可以催化一系列的反应、容易回收（2009.江苏）下列关于固定化酶和固定化细胞的叙述，正确的是（）

A.固定化细胞技术在多步连续催化反应方面优势明显

B.固定化酶的应用中，要控制好pH、温度和溶解氧

C.利用固定化酶降解水体中有机磷农药，需提供适宜的营养条件

D.利用固定化酵母细胞进行发酵，糖类的作用只是作为反应物高考链接A解析：B选项固定化酶不像普通酶那样对环境要求那么高，耐受性比较好，和溶解氧没什么关系；C选项利用固定化酶降解水体中有机磷农药，纯粹的化学反应，不需要提供营养条件，固定化细胞发挥作用需要。D选项利用固定化酵母细胞进行发酵，糖类的作用作为反应底物也为碳源来调节酵母菌的代谢方式。选择题1.下列不属于酶的优点的是（）A.催化效率高B.低耗能C.低污染D.可以反复利用2.在固定化酵母细胞中，海藻酸钠溶液的作用是（）A.固定化酵母细胞B.悬浮酵母细胞C.回收酵母细胞D.催化化学反应DA知识补充1、酶制剂的概念和种类（一）酶制剂含有酶的制品①定义：多酶片、加酶洗衣粉中的蛋白酶和脂肪酶②种类：A、液体酶制剂治疗某些胃病的胃蛋白酶液B、固体酶制剂2、酶的生产①提取法定义：采用一定的技术直接从动植物或微生物的组织、细胞中将酶提取出来优点：简单易行，在动植物或微生物资源丰富的地区具有应用价值实例：在屠宰厂，可以从家畜胰脏中提取出胰酶；在水果加工厂，可以从菠萝皮中提取出菠萝蛋白酶缺点：要有充足的原材料，广泛应用受到限制②发酵法——常用方法定义：通过微生物发酵获得所需要的酶。如果是胞外酶，可以从发酵液中直接提取；如果是细胞内酶，则可将细胞弄碎