电泳技术课程讲义

电泳技术

1937年瑞典化学家Tiselius利用电泳现象制造了界面电泳仪，用于蛋白质的研究。

3.应用

物质性质的研究、种类的鉴定、分离纯化、纯度的分析等。

1.概念

带电粒子在电场中的移动现象称为电泳（electrophoresis）。

2.发展史

1809年，俄国物理学家Reuss进行了世界上第一次电泳实验。第一节电泳的基本原理及电泳类型一、原理

一种粒子，如果能解离或能吸附其它带电粒子，在电场中便会向正极或负极移动。不同性质的粒子由于所带净电荷的种类和数量不同，因而在电场中的迁移方向和速度不同，利用物质的这种性质可对物质进行分离或鉴定。

等电点（isoelectricpointpI）:

兼有酸性基团（如-COOH）及碱性基团（如-NH2）的蛋白质分子，在特定pH溶液中所带正电荷恰好等于负电荷，即分子的净电荷等于零，这时溶液的pH值称为该蛋白质的等电点。此时蛋白质在电场中不移动。

RCOO-

NH3+H+

OH-RCOOHNH3

+RCOO-NH2移向负极移向正极pH=pIpH>pIpH<pI

带电粒子在电场中移动时所受力的作用：

电场力F1=Q·E1）

摩擦力F2=f·V2）相平衡时，则

QE=f·V=6πηrV3）

QEV=━━━━4）

6πηr

（—）

（+）F1F2

迁移率（mobility,

M）

带电粒子在单位电场强度下的迁移速度，可描述带电粒子在电场中移动速度，球形粒子的电泳迁移率和其半径，所带电荷及溶液粘度有关：

M=V/E=QE/6πηr/E=Q/6πηr粒子的迁移率的大小取决于粒子的性质，粒子迁移率的差别决定其能否分离。

二、影响粒子电泳迁移的因素（一）电场强度粒子移动速度与电场强度成正比。

常压电泳高压电泳电压100~500V500~1000V电场强度10~20V/cm20~100V/cm分离时间长，约需数小时到数天短，有时仅需数分钟。（二）缓冲液电泳缓冲液的要求：使被分离的物质稳定，不与被分离物质反应。1.溶液的pH值溶液pH值决定带电粒子解离的强度，也决定其所带电荷数量。当分离某一蛋白质混合物时，应选择一种pH值，其能够扩大各种蛋白质所带电荷量的差异，以利于各种蛋白质的分离。2.离子强度对电泳的影响

在电泳液中的离子增加时会使电泳迁移率降低，原因是带电的粒子会吸引相反符号的离子聚集在其周围，形成一个与运动粒子符号相反的离子氛（ionicatmosphere）,它使该粒子向相反的方向运动，从而降低了该粒子的迁移率。离子的这种阻碍效应是与其浓度和价数相关的。电泳时，缓冲液的离子强度较低，泳动速度快，生热少；离子强度高，泳动速度慢，生热多，但区带较窄。最适离子强度在0.02~0.2之间。（三）支持介质

自由溶液区带电泳的缺点：1.电泳引起的热效应能使液柱对流扰动，破坏正在分离的蛋白质区带。2.扩散作用使蛋白质区带加宽，且电泳结束后还在进行。支持介质能减少扩散，固定蛋白质在最终的位置上，提高分辨率

支持介质选择条件：

1.惰性材料，以不影响粒子电泳迁移率；

2.化学稳定性好；3.重复性好；

4.电渗小等。其它因素如缓冲液的粘度、缓冲液与带电质点的相互作用以及电泳时的温度变化，电压不稳等因素也都能影响电泳速度。

电渗作用（electro-osmosis）

电渗即一种液体相对于带电支持物的移动现象，一般是支持介质内存在某些可解离的基团所致。电渗作用影响较大的有纸电泳、淀粉胶电泳、毛细管电泳等。AB—

—

—

—

—

+++++

+++++—

—

—

—

—

电渗示意图（A、B为固体支持体）+—

分子筛作用:

支持介质，如淀粉胶、琼脂糖凝胶及聚丙烯酰胺凝胶具有分子筛作用。粒子在这种凝胶中电泳时，迁移率不仅与其带电性质有关，而且和它们的分子大小也有关。可根据待分离物的大小，采用不同的交联度以形成不同孔径的凝胶。

支持介质种类：

1.醋酸纤维素薄膜，硅胶，矾土，纤维素等

2.淀粉、琼脂糖，聚丙烯酰胺凝胶。

聚丙烯酰胺凝胶是最常用的支持介质，分辨率高。三、电泳的分类

按载体介质划分1.无支持介质的自由溶液电泳2.有支持介质的电泳(zone-electroph-oresis）包括纸电泳，醋酸纤维薄膜电泳，薄层电泳，非凝胶支持物电泳（淀粉、纤维素、玻璃粉、硅胶等）和凝胶支持物电泳（琼脂糖、淀粉胶、聚丙烯酰胺凝胶、琼脂等）。

U型管电泳按支持物柱状电泳（圆盘电泳）形状划分板状电泳垂直板（见图）水平板毛细管电泳等速电泳按原理划分等电聚焦电泳免疫电泳

分析型电泳按分离规模划分制备型电泳单向电泳按电泳形式划分双向电泳电泳—层析结合

第二节聚丙烯酰胺凝胶电泳一、凝胶聚合原理

聚丙烯酰胺凝胶（PolyacrylamidegelPAG）是由丙烯酰胺单体（acrylamide,Acr）聚合成长链并通过交联剂N、N′甲叉双丙烯酰胺（N、N′PAG，methylenebisacr-ylamide,Bis）与长链末端游离的功能基在有催化剂和增速剂情况下反应聚合而成的具有三维网状结构凝胶。

催化剂：过硫酸胺或核黄素

加速剂:

四甲基乙二氨（

TEMED）

过硫酸铵—TEMED系统：TEMED（N,N,N,N’-tetram-ethylenediamine,）

催化过硫酸铵形成自由基SO42-，使丙烯酰胺单体的单键打开，形成游离基丙烯酰胺，后者和Bis单体作用，聚合成凝胶。调整TEMED或过硫酸铵浓度可以调节聚合反应速率。pH偏低的条件下，聚合反应可能被延迟甚至阻止。

核黄素—TEMED系统：

需要光照来启动聚合反应。核黄素在光照下，部分分解并被还原成无色型核黄素，在有氧条件下，此无色型又被氧化成为带有游离基的核黄素，后者使丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺聚合成凝胶。为加速聚合，在合成过程还加入TEMED作为加速剂促进聚合作用。

过硫酸胺—TEMED系统：

催化化学聚合，形成的凝胶孔径小，重复性好、性质稳定，常用于制备分离胶。

核黄素—TEMED系统：

催化光聚合，形成的凝胶孔径大，且随着时间延长而逐渐变小，不太稳定，常用于制备酸性电泳浓缩胶。时间不受严格限制，通过光照可以调节聚合时间。

丙烯酰胺聚合过程的相关因素：（1）催化剂和增速剂的浓度：过量可引起电泳时烧胶和蛋白电泳带畸变。（2）系统的pH：酸性pH延迟聚合反应。碱性pH易聚合，但胶脆、硬，染色脱色时易破裂。（3）温度影响：低温聚合，胶脆、混浊，重复不好。25-35℃，凝胶透明有弹性。高温凝胶聚合生热使气体溶解，使胶中产生气泡。（4）分子氧：延迟聚合反应。（5）凝胶系统中的不纯物：金属或其它杂质延迟聚合反应。

二、凝胶的机械性能及孔径

凝胶的机械性能、弹性、透明度和粘着度取决于凝胶的总浓度。通常用T%表示丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺的总浓度，即两者在溶液中百分比浓度。

a：丙烯酰胺的量

b：甲叉双丙烯酰胺的量

m：溶液总体积

凝胶的孔径主要受总浓度T%的控制。通常T值越大，平均孔径越小，凝胶的机械性能越强。在T值不变，而甲叉双丙烯酰胺浓度为5%时，凝胶孔径最小，C较大时，如C为20%，凝胶为乳白色。但丙烯酰胺浓度低于2%和N-N′-甲叉双丙烯酰胺浓度低于0.5%时，凝胶不可能聚合。

丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺的比例常用交联度C%表示，即交联剂甲叉双丙烯酰胺所占百分比。

a:b比值<10凝胶脆、硬，呈乳白色>100，T为5%时，凝胶呈糊状。

富有弹性且完全透明的凝胶，其重量比（a:b）在30左右。

Richards在1965年提出便于选择T和C的经验公式：C=6.5~0.3T这个公式能用于计算T为5%~20%时的凝胶的组成。Bis的含量与不同凝胶浓度平均孔径之间的关系总凝胶浓度（％）

平均孔径（Å）

Bis占总凝胶的百分数

6.58.010.012.015.0

1

5

15

25

2423191714

19161497282420———3630—

—

样品分子量与相应的凝胶浓度适用的凝胶浓度（％）

分子量范围

20～3015～2010～155～102～5<1041～4×1044×104～1×1051～5×105>5×105

三、聚丙烯酰胺凝胶电泳的分类

常用类型

圆柱型平板型水平方向垂直方向（一)垂直板凝胶电泳分类：有不连续和连续两种优点：1.表面积大，易于冷却，便于控温；2.电泳结束后，凝胶容易取出；3.能在同一凝胶相同实验条件下，同时点加多个样品，便于比较分析；4.便于用各种方法鉴定；5.平板电泳可做双向电泳。

不连续垂直板凝胶电泳主要用于蛋白质分离，连续垂直板凝胶电泳更多用于核酸研究。（二）水平板电泳分类：中空循环水浴式和半导体冷却系统。优点：1.分辨率高，易使凝胶冷却，可加高电压，且尺寸不受限制，可增加分离距离，提高分辨率；2.快速，全自动水平电泳：30分钟，半自动：1小时左右；3.准确度高，灵敏度高；4.凝胶厚度、尺寸、分离距离任选；5.加样数、位置任选，加样方便，易于自动化；6.染色快，效果好，便于保存，多功能；7.薄胶，可省胶，加样少；等电聚焦可直接测pH。

（三）圆柱型凝胶电泳：

常使被分离的物质成圆盘形区带而相互分离，故常称凝胶圆盘状电泳（discelectr-ophoresis）。

圆柱型凝胶电泳是以垂直方向进行的。凝胶柱(玻璃管)直径约0.5cm的，常用做混合物的分离分析。凝胶柱是直径不超过1cm的玻璃柱，常用作混合物的分离提纯及制备。

柱胶的优点

1）操作简单，能确定蛋白质组分分离时的pH和凝胶浓度。2）样品容量大，配有自动切胶装置，适用于标记有同位素的蛋白质生物活性测定分析；3）用于双向电泳技术四、连续凝胶电泳和不连续凝胶电泳连续凝胶电泳不连续凝胶电泳凝胶系统一层两层，不同孔径所用的缓冲液pH值相同不同电泳过程中形成的电势梯度均匀不均匀操作简单复杂，但分离效果好应用主要用于核酸研究主要用于蛋白质分离

（一）连续凝胶电泳和不连续凝胶电泳的区别

连续及不连续缓冲系统的板状凝胶

电极上贮液槽缓冲液浓缩胶分离胶下贮液槽缓冲液样品池

1.样品的浓缩效应：

1）凝胶层的不连续性：凝胶孔径2）缓冲液离子成分的不连续性3）pH值不连续性：2.分子筛作用(molecularsievingeffect)：凝胶浓度网孔大小蛋白质分离3.电荷效应：所带电荷移动速度

8.38.38.96.7（二）不连续系统凝胶电泳的分离原理蛋白质不连续系统浓缩分离原理-------------------------------------------

-------------------------------------------

----------------------------------------------贮液槽缓冲液(Tris-G)pH8.3--样品Tris-HClph6.7浓缩胶Tris-HClpH6.7分离胶Tris-HClpH8.9贮液槽缓冲液(Tris-G)pH8.3+++蛋白质在甘氨酸和氯离子界面间浓缩蛋白质在分离胶中分级分离

电泳开始时在浓缩的过程中在分离胶中分离时

浓缩胶和分离胶PH的不连续，是为了控制慢离子的解离速度，从而控制有效迁移率。

电泳液(PH8.3)中含甘氨酸离子；样品及浓缩胶缓冲液（PH6.7）中含Cl-；分离胶缓冲液（PH8.9）也含Cl-。PH8.3时，甘氨酸-慢离子；盐酸中的Cl-

称为快离子。而PH6.7时，蛋白分子的有效迁移率介于两者之间。电泳开始后，浓缩胶内的Cl-快速向阳极移动，蛋白质和甘氨酸离子移动慢，从而形成一个高电位差，并加速了蛋白质和甘氨酸离子向阳极移动。一定时间后，这两种离子与Cl-的速度相差不大，而形成一个稳定的不断向前移动的界面。（三）解离和非解离系统

根据研究目的不同，聚丙烯酰胺凝胶电泳的缓冲溶液可分为非解离系统和解离系统。

解离系统：在缓冲体系中加入解离剂，破坏分子内的非共价键，适用于测量亚基分子量。常用：SDS，巯基试剂、尿素等。

非解离缓冲系统:不加解离剂，分离天然蛋白质。能保存天然蛋白质的构象、亚基及其生物活性。

十二烷基磺酸钠（SDS）1.阴离子表面活性剂：它能够与蛋白质多肽链中的氨基酸残基按大约1:2比例结合。破坏蛋白质分子之间的氢键和疏水作用，破坏蛋白质分子的二级和三级结构，变成只含有一级结构的肽，并保持蛋白的溶解性。其分离作用只受多肽分子的大小影响，蛋白质在电场中的泳动距离只与分子量有关。2.SDS掩盖蛋白质本身所带电荷，使蛋白质能够根据本身分子长度的大小带有相应的负电荷。每一个蛋白质分子都因为结合了许多的SDS而带有大量的负电荷，使蛋白质丧失了原有的电荷状态，形成仅保持原有分子大小为特征的负离子团块，从而消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异，因此在进行电泳时，SDS-蛋白复合物在PAGE中的迁移速率只取决于蛋白的分子量大小。3.作用浓度8×10-4mol/L，1克蛋白质几乎能恒定地与1.4克SDS结合。4.以SDS作解离剂，天然细胞的胞溶物至少有90%可以进入凝胶。

尿素

1.通过破坏氢键起作用。2.作用浓度较高（8mol/L）。3.分离作用受分子大小和电荷双重因素的影响，不能精确测定分子量。4.高达50%的复杂蛋白混合物不能进入凝胶。

聚丙烯酰胺凝胶电泳的优点：

1.是目前分辨能力最高的电泳支持体；2.化学稳定性好，纯度高，溶解度小，无电离基团，随pH值和温度变化较少，无吸咐及电渗现象；3.通过改变交联度调节孔径大小，能精细地分离各种蛋白质组分。

缺点:1.聚合容易受各种因素干扰;2.对神经系统及皮肤有毒。五、聚丙烯酰胺凝胶电泳的用途

1.适用于少量样品的分离鉴定;2.较多样品的分离制备;3.测定蛋白质或核酸的分子量、核酸的序列分析等。第三节常用聚丙烯酰胺凝胶电泳技术

配液：丙烯酰胺溶液、过硫酸铵，TEMED，SDS等制胶：清洗玻璃板，组装灌胶装置，胶液混合、灌胶样品处理：上样样品除盐、上样、Marker处理电泳：摸索适宜的电泳条件，保证实验结果可重复性

染色，检测，结果分析，可进一步做转移或杂交

一、非解离不连续系统凝胶电泳（一）配液:

1.丙烯酰胺及甲叉双丙烯酰胺单体固体状态在室温至少稳定一年。长期贮存时丙烯酰胺单体可水解产生丙烯酸和氨。溶液在自然光和射线及超声波引发下会发生聚合，应装入深色瓶中于4℃贮存。为了保证实验结果及重复性，每次只应制备供用1~2个月的丙烯酰胺-甲叉双丙烯酰胺贮备液。2.TEMED

应密封置于冰箱中贮存，使用的量应使凝胶能在30～60分钟内聚合完成。3.过硫酸铵

应在使用前配置。配置好的溶液应在冰箱中存放，使用期不超过1星期。存放1星期后的过硫酸铵，可能仍会起作用，但不适用来作精细的分析工作。

（二）样品制备

1.选择合适的样品缓冲液（1）选择合适的pH和离子强度，保证样品的溶解性、稳定性和生物活性，通常使用与凝胶缓冲系统相同的pH。（2）为了观察电泳前沿，在样品缓冲液中应加标志染料，碱性电泳一般用溴酚蓝，酸性电泳则用甲基绿。（3）加入增加密度的甘油或蔗糖.2.样品处理（参考）a.蛋白样品制备、测定蛋白浓度；b.稀样品浓缩，过柱除盐；c.如溶解不佳，可加助溶剂，如用尿素和非离子去污剂NP-40等；d.按测定好的蛋白浓度，将蛋白样品与一定比例的上样缓冲液混合，于100℃沸水中煮沸5min，让蛋白充分变性；e.离心去杂质，避免电泳拖尾。

3.样品浓度

取决于样品的组成、分析目的和检测方法，对未知样品可作一个0.1~20mg/ml蛋白的稀释系列，以寻找最佳加样浓度。如用考玛斯亮蓝染色，可用1~2mg/ml的样品，对高纯度样品0.5~2mg/ml蛋白为最佳。银染色所用的样品浓度可比考玛斯亮蓝染色低20~100倍。电泳后欲进行转移，应有足够的样品量。

注意:制备天然蛋白质样品在低温（1~4℃）下进行，以防失活和减小蛋白酶对样品的水解。短期保存:贮于4℃含甘油的样品缓冲液中。若蛋白质样品在上述条件下稳定，可冰冻长期保存。

4.蛋白标准的准备测定分子量时须准备蛋白标准样品。选择合适分子量范围的市售蛋白标准，溶解在样品缓冲液中，分装，-20℃保存。

note：不要错用蛋白标准。电泳的三部曲制胶电泳检测

垂直板式电泳槽（三）制胶

电泳用玻璃板需在清洗液中侵泡过夜，然后用蒸馏水清洗，再用乙醇浸洗并干燥。组装灌胶装置。取出凝胶溶液平衡至室温（23～25℃）；确定适宜的分离胶浓度后，按下表各组分（TEMED除外）配胶；用抽真空泵将混合液体脱气5分钟，加入TEMED，并温和地混匀溶液；将胶液缓慢加入制胶装置。试剂浓缩胶（T=5%）分离胶（T=15%）

双蒸水胶储（母）液分离胶缓冲液浓缩胶缓冲液

10%SDS10%过流酸铵

TEMEED5.5ml1.3ml——1.0ml0.08ml0.08ml0.15ml2.4ml5ml2.5ml——0.1ml0.05ml0.01mlSDS不连续电泳用凝胶配方（范例）（四）加样和电泳

加样：用微量注射器或微量移液器。

note:上样时要保证每个泳道内的总蛋白量相等，这样才能比较不同样品中目的蛋白含量的差异。注意事项：1.加样器的顶端应保持在凝胶表面以上1~2mm处，使加样时的样品与贮液槽缓冲液的混合减至最低程度。2.样品加成细窄带，以保证分辨率。3.凝胶中的空白样品槽以等体积空白样品缓冲液注满，以防临近带扩散。4.阳极电泳样品加在阴极侧，阴极电泳样品加在阳极侧。

电泳：

1.加电泳缓冲液于电泳槽的下槽中。要从凝胶底部除气泡，否则会妨碍凝胶和贮液槽缓冲液之间电路接触。2.对于SDS或其它缓冲系统中带负电荷的蛋白质电泳，电源的正极与下槽相连，负极与上槽相连（若带正电荷的蛋白质电泳，则贮液槽的极性应颠倒）。3.电泳：恒压，恒流，恒功率。（五）凝胶的染色—分离区带的检出

1.蛋白质的染色1)黑10B（amidoblack10B）2)考马斯亮蓝R-250（CoomassiebrilliantblueR-250）

3)考马斯亮蓝G-2504)固绿（fastgreen）5)普施安亮蓝RS（ProcionbrillantblueRS）蛋白质的一般染色方法固定和染色常可同时进行。因为，染料的溶剂一般就是固定剂。常用的几种染色方法简述如下：1）黑10B（amidoblack10B）用7％的醋酸配制0.5％～0.1％的染料溶液，浸染2～6小时，染色后用水洗。用7％的醋酸配制1％的染料溶液，96℃保温染色10分钟，可以改善对弱区带的分辨率。2）考马斯亮蓝R-250a.先用12.5％三氯醋酸固定数小时，出现白色沉淀条纹后，在三氯醋酸中滴加少量1％考马斯亮蓝R-250溶液，过夜，用此法染色底色很浅，通常染色后不需要脱色。b.或用0.25％考马斯亮蓝R-250的甲醇-醋酸混合液（454ml50％的甲醇＋46ml冰醋酸）染色2～10小时。c.或先用20％磺基水杨酸固定18小时，然后用0.25％考马斯亮蓝R-250的无重金属离子的水溶液染色0.5～2小时。或用0.25％考马斯亮蓝R-250的9％醋酸和45％甲醇混合液染色0.5～2小时。3）考马斯亮蓝G-250先在5％三氯醋酸中固定30分钟，水洗几次，然后用1％该染料的7％醋酸溶液，染色10分钟。或用0.1％该染料的甲醇：水：醋酸（10：10：1v/v）混合液，染色30分钟。

4）固绿（fastgreen）

用1％固绿的7％醋酸溶液，染色2小时。最好在10℃以下进行。5）普施安亮蓝RS（ProcionbrillantblueRS）

先在20％磺基水杨酸固定0.5～2小时，然后用1％该染料的10％醋酸和50％甲醇混合液染色1～2小时。6）0.1％考马斯亮蓝R-250

溶剂使水：甲醇：冰醋酸（5：5：2），使用前用滤纸过滤去除不溶物。柱状凝胶条室温染色至少4小时。1.5mm厚的平板凝胶，室温染色4～6小时。7）硫酸铜-考马斯亮蓝混合染色液

10g硫酸铜定溶于800ml蒸馏水中，再加入200ml醋酸作为染色贮备液A。3g考马斯亮蓝G-250溶于900ml甲醇中，再加蒸馏水至1000ml作为染色贮备液B。使用前等体积搅拌混合A和B。染色30分钟至数小时视不同样品而异。（2）含金属蛋白质的染色取醋酸钠（三水合物）16g溶于100ml17％的醋酸中此溶液用1％EDTA-Na2溶液饱和，过滤，滤液再用联苯胺盐酸盐饱和。再过滤，取滤液（贮存液10ml加入3％H2O20.1ml，然后将凝胶条浸入此混合溶液中），于20℃染色30～40分钟。（3）脂蛋白的染色取50g苏丹黑B（SudanblackB）溶于20ml丙酮中，然后加入15ml醋酸和80ml水的混合液，搅拌30分钟后，离心。取上清液染色过夜。此染料仅在2天内稳定。（4）糖蛋白的染色所有操作应在4℃下进行。将凝胶浸入含有2.5g过碘酸钠、86ml水、10ml冰醋酸、2.5ml浓盐酸和1g三氯醋酸和90ml水的混合液，洗涤8小时，其间更换几次洗涤液。然后，取出凝胶再用Schiff试剂染色16小时。再在1gKHSO4和20ml浓盐酸及980ml水的混合液中浸洗2次，2小时。也可再用0.5％氨基黑10B的5％醋酸溶液在20℃复染2小时。（5）核酸的染色1)RNA的染色

在0.5％焦宁

Y（pyronineY）(用醋酸：甲醇：水=1：1.8v/v为溶剂)和1％乙酸镧混合液中，染色16小时。

或先在1mol/L醋酸中固定10～15分钟，然后用2％次甲基蓝的1mol/L醋酸溶液染色2～4小时。或用0.05％甲苯胺蓝

O（toluiclineblueO）的15％醋酸溶液染色1～2小时。或用溴化乙锭荧光染料染色。方法是：用电泳缓冲液作溶剂，配制溴化乙锭（ethidiumbromide）的浓度为1μg/ml，浸染20～30分钟，然后在紫外分析灯（253nm）下观察荧光。2)DNA的染色

0.25％甲基绿溶于0.2mol/LpH4.1的醋酸缓冲液中，用氯仿抽提至无紫色。然后，将凝胶浸入其中，室温染色1小时。或用2％焦宁Y-1％乙酸镧-15％醋酸混合溶液，染色过夜。或用溴化乙锭染色，方法同RNA。蓝染色：考马斯亮蓝（

R-250）方法：可先固定，再进行染色和脱色。或同时进行固定和染色，再脱色。时间：固定和染色的时间取决于凝胶的厚度，孔径及有否支持膜。加速染色和脱色：加温、搅拌染色液和脱色液。

银染色的原理是将蛋白带上的硝酸银（银离子）还原成金属银，以使银颗粒沉积在蛋白带上。

在银染过程中，首先要将蛋白质固定,以阻滞它们在凝胶中的扩散。去除干扰染色过程的物质，如去污剂，还原试剂和缓冲液的成份（如甘氨酸）。

银染色：

银染色的显色方法：

化学显色（chemicaldevelopment）双胺银染法（diaminesilverstains）;双胺化学显色银染法（nondiaminesilverstains）。

光显色（photodevelopment）

光还原银离子成金属银，使用单一染色溶液可完成。

2.脱色

扩散脱色法：将凝胶转移至脱色液中脱色。

电泳仪脱色:由于考马斯蓝是阴离子型染料，所以可用脱色仪用7％醋酸充满，脱色15－30分钟内完成。

（六）电泳后的凝胶干燥目前有两种方法：>1.0mm厚度凝胶：凝胶干燥仪<1.0mm厚度凝胶：自然干燥法二、浓度梯度凝胶电泳（gradientgel）

是指分离胶部分由一定的浓度梯度组成，梯度胶适合于复杂样品的分析。（一）基本原理在同一凝胶柱（或板）中，从上到下形成不同浓度凝胶；凝胶孔径大小相应成梯度。（二）凝胶浓度梯度分类阶梯式连续浓度梯度直线性连续浓度梯度指数的连续浓度梯度（三）浓度梯度凝胶电泳的优缺点优点：1.具有浓缩样品组分的作用，稀样品分次加样。2.能提供更清晰的蛋白质谱带，用于鉴定蛋白质的纯度。3.可以在一个凝胶片上同时测量分子量范围相当大的蛋白质，如：胶浓度4－30％梯度胶可以分辨的分子量为50,000-2,000,000。4.可以直接测定天然状态蛋白质的分子量，不需解离为亚基。这一方法可与SDS凝胶电泳测定分子量的方法相互补充。

缺点：主要适宜于测定球蛋白的分子量，对纤维蛋白（线形）将产生较大的误差。（四）梯度凝胶电泳法测定蛋白的分子量1.仪器的准备1）垂直板型电泳槽；2）梯度混合器。2.5-20％梯度胶的制备多采用SDS-不连续缓冲系统。注意事项:（1）两种浓度胶液，高浓度的丙烯酰胺混合液有15％（重量／体积）蔗糖，稳定密度梯度。（2）聚合催化剂的数量适当减少，以防早凝.三、蛋白分子量的测定1.标准曲线的制作

以凝胶片的前沿或迁移距离最大的标准蛋白质为参考点，计算每种标准蛋白质的相对迁移率（Mr）

2.蛋白质的MW与电泳迁移率(m)间的关系

MW=K(10-bm)lgMW=lgK-bm=k1-bm

未知样品分子量的测定：

测量出未知蛋白质的相对迁移率，利用标准曲线便可计算出分子量。标准蛋白质在SDS凝胶上的分离示意图加样孔电泳方向染料前沿染料迁移距离样品迁移距离123451.细胞色素C2.胰凝乳蛋白酶原3.胃蛋白酶4.卵清蛋白5.牛血清白蛋白6.测试样品lgMWmlgMW=k1-bm6m6lgMW6四、Westernblot（蛋白印迹）

将经过SDS分离的蛋白质电转移到固相支持物上（如NC膜、PVDF膜），用特异性一抗与膜上的蛋白结合，再用酶标二抗（如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶）与特异性一抗作用，最后以发色底物显色。（一）转膜（湿转和半干转）

按蛋白分子量大小确定合适的电压或电流以及转膜时间：1.分子量较小的蛋白（30-50kDa），转膜条件为50V，2h；2.分子量较大的蛋白（>100kDa），转膜时100V，2h，在冷环境下完成。（二）封闭封闭的作用：PVDF膜在活化后是带电的，因而在转膜时会吸附蛋白。为阻止PVDF膜与抗体（蛋白）的非特异性结合。用脱脂奶粉或BSA将PVDF膜上无蛋白的部分空隙填满，以免孵育抗体的时候一抗二抗与之结合，产生非特异条带或者是背景杂乱。5%脱脂奶粉或5%BSA，室温2h/4℃过夜。（三）抗体孵育膜浸泡在一抗工作液里，4℃孵育过夜（室温2-3h）。2.膜浸泡在二抗工作液里，37℃或室温孵育1-2h。（四）显色辣根过氧化物酶标记二抗：DAB显色，或ECL发光成像；2.碱性磷酸酶标记二抗：CIP/NBT显色。DAB显色ECL发光成像BCIP/NBT显色第四节等电聚焦电泳（Iso-electricfocusing,IEF）

一、概述依据蛋白质具有两性解离及等电点（PI）的特征，利用具有pH梯度的电泳介质来分离pI不同的蛋白质的电泳技术，主要特点是灵敏度及分辨率高，其分辨率较不连续性PAGE更高，可达0.02pI，特别适合于分离分子量相同而电荷量不同的两性大分子；重复性好，适用于大批量纯度检测和真实性鉴定以及遗传多样性等群体生物学领域的研究。二、基本原理

将蛋白质放在由两性电解质形成的pH梯度中，可以依不同蛋白质的等电点不同，达到分离的目的。

RCOO-

NH3

+H+OH-RCOOHNH3

+RCOO-NH2移向负极移向正极pH=pIpH>pIpH<pI

在没有电场时，载体两性电解质溶液的pH值大约是该溶液pH范围的平均值(如pH3-10的载体两性电解质溶液，其pH约为6.5左右)。所以载体两性电解质分子都带有电荷，只是在溶液中的正电荷和负电荷数目相等，净电荷为零。引入电场时，载体两性电解质分子分别向阴极和阳极移动，最终在分子净电荷为零的位置停止迁移。（一）电场下载体两性电解质的变化

+–--------------------------––––+++++---------+++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++---------------------------------------

----------–––––---

++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++—+—载体两性电解质在电场中形成pH梯度的模式图+：常为磷酸、硫酸、醋酸等-：常为氢氧化钠、氢氧化铵等(1)靠近阳极端的载体两性电解质，电负性最强，具有较强的缓冲氢离子的能力，使环境的pH等于载体两性电解质的pI，一直向阴极顺延；(2)靠近阴极端的载体两性电解质，电正性最强，具有较强的缓冲氢氧根离子的能力，使环境的pH等于载体两性电解质的pI，一直向阳极顺延。利用两性电解质载体形在电泳系统中建立一个由阳极至阴极，pH由低到高，即环境由酸到碱的连续而稳定的pH梯度。处于这个系统的各种蛋白质分子将根据各自的pI值与所处位点的pH值的差别带上正电或负电。当其处在低于其本身等电点的环境中则带正电荷，向负极移动；若其处在高于其本身等电点的环境中，则带负电向正极移动。当泳动到其自身特有的等电点时，其净电荷为零，泳动速度下降到零。具有不同等电点的蛋白质最后聚焦在各自等电点位置，形成一个个清晰的区带，分辨率极高。电泳管介质中稳定的pH梯度蛋白质在pH梯度中的形成示意图电泳行为

-------pHpHbpI0pHapHpH--------------pHbpHbpInpI1pHapHa+++---pI2+-------pH增加pH=pI-+pI1pI4pI3pI2pI5a:分子在负极端b:分子在正极端C:各蛋白质组分聚焦成分散的区带acb（二）两性电解质载体

pH梯度制作利用的两性电解质是一种多羟基、多氨基的小分子脂肪族化合物，他们具有相近但不同的pKa和pI值。在外电场作用下，自然形成稳定的pH梯度。能建立pH梯度两性电解质，常称为载体，商品名称因生产公司不同而异。如:LKB-ampholine、PhamaciaPharmalyte、Bio-Rad-Lyte等。①各组的PI彼此十分接近，并在其等电点附近有良好的缓冲能力，保证pH梯度的稳定；②各成分的导电能力彼此接近，使电泳介质中电位降分布均匀，以免聚焦时，局部过热而影响分离或影响样品性质；③分子量低，能与样品分离；④化学性能稳定，与被分离物质不起化学反应，也无变性作用；⑤在280nm处紫外吸收值低，不干扰样品的测定。

理想的两性电解质载体需要具备以下特点：

两性电解质的选择：

根据蛋白质的PI而定。如知道某种蛋白质的PI值，即应选择包括此PI在内的小范围的两性电解质，如不清楚测定或分离的蛋白质的pI值，则可采用pH值较广的（pH3-10）的两性电解质，待了解PI后，再选用窄范围的两性电解质，以便获得较高的分辨率。（三）支持介质

即凝胶物质，以形成稳定pH梯度，减少对流后扩散的影响。有PAG、葡聚糖或琼脂糖凝胶。聚丙烯酰胺凝胶（采用5％凝胶）弹性好。浓度高时有分子筛作用，不适用于大分子物质的分离。分子量超过1.0×105的蛋白分子采用低浓度（2％－3％）聚丙烯酰胺，再根据需要加入0.5％－1％的琼脂糖，才能保持较好的机械强度。三、IEF分类1.载体两性电解质pH梯度(carrierampholytepHgradient)等电聚焦：即在电场中通过两性缓冲离子建立pH梯度。2.固相pH梯度(immobilizedpHgradients,IPG)等电聚焦：是利用一系列具有弱酸或弱碱性质的丙烯酰胺衍生物滴定时，在滴定终点附近形成pH梯度，并参与丙烯酰胺的共价聚合形成固定的、不随环境电场条件变化的pH梯度，分辨率可达0.001pH。3.载体两性电解质/固相pH梯度混合技术：即在固相pH梯度凝胶中加入载体两性电解质作为添加剂，被称为“杂交等电聚焦”。固相pH梯度等电聚焦与载体两性电解质等电聚焦的区别：前者不是两性分子，在凝胶聚合时便形成pH梯度；后者是两性分子，在电场中两性分子迁移到自己的等电点而形成pH梯度。

1.配胶胶液组成为载体两性电解质、凝胶贮液、蒸馏水、混合样品、染色物质等；2.灌胶注意不要产生气泡，冷却2h后可接入电泳池；3.加电极液4.电泳5.样品收集检测四、简单操作步骤（一）常用电泳仪（二）凝胶的制备等电聚焦电泳可采用两种方式：柱状：垂直式。板状：水平板电泳。五、电泳（聚焦）聚焦：阳性溶液采用稀酸，如2％硼酸溶液或0.1MH3PO4；阴性溶液采用稀碱，如0.5％（V／V）乙醇胺溶液或0.1MNaOH。提高分辨力：高电压，配有相应的冷却系统。样品低盐：浓度<5-10M，如果样品在低盐浓度下溶解度不好，可适当加入非离子型的去污剂增溶。上样：柱状电泳可直接在顶部上样，或混入胶液中一起制胶，板状聚焦可将样品滴在滤纸片上放在凝胶表面。六、染色、脱色

染色：两性电解质可和蛋白质染料结合，聚焦后不能直接染色，要先固定，即把胶浸在5％的三氯醋酸溶液中，同时去除两性电解质。再用考马斯亮蓝染色。

脱色：用7％－10％的醋酸脱色。七、pH梯度的测定和PI的确定方法1：将聚焦后的凝胶顺pH的方向切成若干等份（如0.5cm为一段），各小段凝胶分别浸泡在双蒸水(1ml)中过夜，测定pH。或直接用表面微电极在胶面上读出不同位置的pH值。方法2：标准曲线法

加入等电聚焦mark作为标准，以胶的长度为横坐标，pH值为纵坐标，绘制胶内的pH梯度线性曲线。从蛋白质染色位置上结合标准曲线判定PI值。

八、等电聚焦中注意的几点1.选择合适的pH梯度。2.IEF如在宽pH范围内进行，为了克服在中性区域形成纯水区带，可适当添加中性载体两性电解质。3.为防止电泳过程中pH梯度的衰变，应在电流降低达最小而恒定时尽快结束IEF。4.为防止蛋白质沉淀，可在样品中添加脲，TritonX-100或其他非离子表面活性剂。5.IEF样品应除盐。6.所用试剂要求高纯度。九、IEF的优点1）分辨率高，可分辨相差0.01pI单位的蛋白组份。2）样品体积和加样位置不受严格限制，样品可混入胶中或放在任何位置。3）蛋白质分离快速，一般可在2小时完成。电泳结束即可测定蛋白质pI。4）载体两性电解质分子量小，不易与蛋白质反应和使之变性，因此只需硫酸铵沉淀，通过透析和分子筛、电泳等方法很易与蛋白质分开。5）IEF分离获得的蛋白质基本上可保持原有的生物活性。

十、IEF的缺点：1.许多蛋白质在pI附近会产生沉淀2.高电压，产热高，样品中除盐，造成蛋白质溶解差；3.两性电解质可与蛋白质间有静电作用而紧密结合，形成的复合物可能导致它与抗体反应降低或使酶活性降低。可通过高离子浓度（0.1mol/L或更大到0.5mol/L）、pH7左右的挥发性缓冲液破坏它们的静电作用。十一、等电聚焦电泳的应用

IEF是一种简便、快速、高效的分离分析方法，特别适用于氨基酸、多肽、蛋白质、酶类和抗体等的分离分析。能够满足组分定量、杂质检出、质量控制、临床诊断等方面的要求。目前在同功酶的鉴定及蛋白质的微量分析(10~50μg)上应用尤为广泛。随着生命科学的发展，特别是人类基因组计划(HGP)全面完成之后，所谓“后基因组”时代的来临，对复杂生命体系的准确表征和分析就显得日益紧迫，其中蛋白质组研究是一个极其重要的部分。历史：

1975年O’Farrell首先建立

双相凝胶电泳实质：

第一相(向)：等电聚焦电泳，蛋白质根据电荷分离。第二相(向)：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，根据蛋白质分子量大小分离第五节双相凝胶电泳（IEF／SDS)

(一)双相电泳特点：

避免了两种或两种以上的多肽，特别是复杂的蛋白质混合物在同一蛋白区带共同迁移的现象。多肽的共同迁移不仅掩盖了蛋白质真实的复杂性，也掩盖了各区带中某些组成数量上的变化。双相电泳的两相根据不同原理进行分离，除能改善分离外，若分离条件理想，还可获得与多肽基本参数有关的更多资料。

（二）双向电泳意义1.当前分子生物学研究领域中常用的技术。对于生物大分子蛋白质的分离和分析极为精确而有效。唯一的可用于对大量蛋白质混合物进行同时平行定量的技术。广泛应用于真核和原核生物许多类型的细胞蛋白质研究。2.短时高效。IEF可在2－4小时完成，垂直板电泳可在35－45分钟内完成。双向电泳可在一天内完成。3.分离复杂的蛋白混合物，高分辨率，常规至少可分离2000个蛋白，<1ng4.电泳根据等电点和分子量反映蛋白表达差异，鉴定蛋白亚型，发现翻译后修饰的蛋白（如磷酸化、糖基化）。5.结合同位素标记蛋白质技术可分辨出细胞中1000多个多肽，并可探测到细胞总蛋白0.001％或更少的量。6.结合质谱或Edman蛋白测序，对蛋白进