常规细胞培养要点

常规细胞培养要点初步掌握基本的无菌操作要领养成良好的无菌操作习惯形成可持续的实验环境促进实验的顺利进行操作准备环境消毒1将实验所需大中小已高压灭菌枪盒，移液器，已高压灭菌铝制饭盒（内装1.5mlEP管或15ml，50ml离心管，5ml枪头等）放入无菌操作台。2无菌操作台及房间实验前紫外消毒半小时。3操作时关闭房间紫外，通风5-10min，关闭操作台紫外，打开风机及照明。操作准备实验准备1换上专用实验服和手套，并用消毒酒精消毒手套2用75%酒精擦拭放置显微镜的桌面及显微镜载物台并打开显微镜3打开CO2培养箱取出细胞置于显微镜上观察，以此决定进行何种操作。若发现细胞有污染，及时将其丢弃。（垃圾桶分干湿两种，带液体的东西弃于湿桶，请勿混弃）4用75%酒精擦拭无菌操作台的台面，从冰箱中取出1×PBS1×Trpysin以及合适的培养基，用消毒酒精擦拭其外表面后放入操作台（培养基混匀确认其无浑浊）

贴壁细胞的换液与传代换液1吸弃培养盘内的液体再换入新鲜完全培养液。大部分细胞培养一般用DMEM+10%FBS,或用MEM,RPMI-1640。用其他特殊培养基的细胞可在ATCC网站查询或询问来源地。2盘内排除污染的情况外，若有较多悬浮物可用1×PBS洗一遍后再加新鲜培液。3放回培养箱贴壁细胞的换液与传代传代1吸弃上清，加入1×PBS清洗剩余培液后加入1×Trpysin进行消化，期间应将其放入培养箱，温度适于胰酶消化。时不时将其取出放镜下观察掌握消化进程（制定一个时间梯度，如：2min，5min，10min等）镜下观察细胞从多变体或梭状等皱缩为圆球状，轻敲盘边就飘起移动即为消化完全。贴壁细胞的换液与传代传代2加入完全培液终止消化，终止体积至少为1:11）实验目的仅为留种则从细胞悬液中取出一部分丢弃后再补足培液。若细胞对胰酶敏感则需要将剩下的细胞悬液移至离心管离心去上清后用培液重悬重新铺板。2）按实验要求分盘则需现对细胞进行计数。之后按计数结果计算后分入相应培养盘。

3）将分好后的细胞放回培养箱

计数方法用70%酒精清洁血红细胞计数板和盖玻片，镜头纸擦干；取20μl细胞悬浮液小心地从盖玻片的边缘加入血红细胞计数板的两个室，通过毛细管作用，细胞悬浮液在血红细胞计数板和盖玻片之间均匀地分布；切勿加入过量，只要充满即可。置入显微镜，用10倍的目镜和10倍的物镜观察细胞，统计其中四个大的方阵中的细胞数，如果细胞浓度太高，可稀释再统计，记住稀释的倍数；细胞浓度=（四个方阵中细胞数之和/4）X104/ml，方阵上方和左边边缘的细胞可统计在内，但下方和右边边缘的细胞则不应统计，如有细胞团计为一个。用70%酒精和蒸馏水清洁血红细胞计数板和盖玻片，镜头纸擦干。计数方法细胞计数板的基本结构和计数范围

血红细胞计数板(hemocytometer)

含有两个室，每个室被划分为9个方阵，其中4个方阵有16个小方格，为0.1mm3

或1x10–4

ml，细胞浓度。取决于已知体积中的细胞数细胞的冻存与复苏冻存1准备好冻存细胞所需的低温冰箱，液氮罐及液氮，细胞冻存管并写好标签：细胞名称，时间及保存人；2取对数生长期的细胞（融合度达70-80%），收集细胞前24h换液一次3吸出培养液，用PBS洗细胞一次，除去，加入1mlTrypsin-EDTA,放入37℃保温3-5min,使细胞脱离底部；4离心细胞并重悬浮于10%DMSO/90%FBS中，大约1-5x106cells/ml5每个冻存管中加入1ml细胞悬浮液，拧紧盖子6冷冻细胞应缓慢降温，可用装有异丙醇的冷冻盒(每两个小时温度下降10℃)，放入-20℃冰箱中过夜，第二天再转至-80℃冰箱，可保存数月，如需长期保存，应转至液氮中。细胞的冻存与复苏复苏

在37℃水浴中预热培养基；将冻存的细胞从液氮中取出，迅速放入37℃水浴中至解冻，用纸巾擦干管外水分，70%酒精消毒；）检查盖子是否旋紧，由于热胀冷缩过程，此时盖子易松掉。）操作人员应戴防护面罩及手套，防止冷冻管可能爆裂之伤害。将细胞用移液管放入适量预热的培养基中，混匀，放入37℃，5%CO2培养箱中培养；由于细胞保存液中通常含有DMSO，对细胞生长有毒性，应除去。对于贴壁细胞，待其贴壁后，更换新鲜培养基；对于初始细胞，悬浮培养的细胞以及一些敏感细胞类型应及时通过离心除去DMSO操作注意点实验操作应在台面之中央无菌区域，勿在边缘之非无菌区域操

作。小心取用无菌之实验物品，避免造成污染。勿碰触吸管尖头部或是容器瓶口，亦不要在打开之容器正上方操作实验。操作时所用容器若非必须不要有两个以上开口。容器打开后，尽量勿将瓶盖盖口朝上放置桌面。平移取物时不要经过开口上方，绕过去。操作时若操作面有液体或杂物要及时清理，随时保持清洁。若大多数容器为塑料制品时，慎用酒精灯，以免因受热变形造成密封不佳。操作注意点培养容器保持清洁，培养容器特别是盘盖和瓶盖内侧建议用真空吸液泵清洁由内而外。使用移液器和移液枪若不慎吸至枪体和移液管上方棉塞，枪头，移液管及内容物丢弃。实验结束整理清洁台面：1）调枪至最大量程；2)空枪盒，饭盒，捆绑绳带出细胞房至装填处；3）冰箱拿出的东西放回冰箱，空管空瓶丢入湿桶，废液缸内容物倒入湿桶并用酒精消毒放回；4）酒精擦拭台面，关门，关风机，关照明，开紫外。细胞培养的污染及控制细菌污染培养细胞受细菌污染后，会出现培养液变混浊，pH改变。也有的培养液肉眼观察无多少改变，只能在镜下发现菌体才知污染。所以，每天应仔细观察。污染后细胞发生病理改变，胞内颗粒增多、增粗，最后变圆脱落死亡。污染后重要的细胞加PS，不重要的丢弃。真菌污染真菌污染是细胞培养过程中最常见的一种，尤其在霉雨季节进行细胞培养更易污染。培养细胞受真菌污染后，可见培养液中漂浮着白色或浅黄色的小点，有的散在生长，培养液一般不发生混浊；倒置显微镜下可见丝状、管状或树枝状的菌丝纵横交错在细胞之间或培养基中，有的呈链状排列。念珠菌和酵母菌呈卵圆形散在细胞周边和细胞之间。个体细小，有增多趋势。镜下看时，要将培养瓶用酒精棉球擦干净，以防止与瓶外尤其瓶底外面生长的菌丝相混淆。真菌污染后，细胞生长变慢，但最后由于营养耗尽及毒性作用而使细胞脱落死亡。污染后丢弃。细胞培养的污染及控制支原体污染多吸附于细胞表面或散在于细胞之间，污染后，培液背景像罩了纱雾状的东西看不清。部分敏感细胞可见细胞生长增殖变慢，部分细胞变圆，从瓶壁脱落。但多数细胞污染后无明显变化，或略有变化，若不及时处理，还会产生交叉污染病毒污染本实验室一般是293感染腺病毒细胞产生病