质谱技术简介及其在医学检验中的应用

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医学检验中的应用

MSTechnologyinmedicallaboratory2021/4/263质谱

•光谱通常医学检验方法是基于光谱的分析。质谱是运用电磁学原理，对荷电分子、亚稳分子碎片进行分离、分析，与光谱学分析完全不同。随着质谱技术的发展，质谱在质检、环境、临床检验中的应用越来越广泛。2021/4/264准确快速高通量微量检测成本低能够分析分子结构质谱的特征2021/4/265CONTENT目录质谱在临床检验中的应用质谱仪的工作原理质谱仪的分类2021/4/266CONTENT目录质谱仪的工作原理2021/4/267质谱仪是按照离子的质荷比(m/z)不同,来分离不同分子量的分子.测定分子量进行成分和结构分析.离子的生成方式有失去或捕获电荷(如:电子发射,质子化或去质子化)2021/4/268计算机数据处理系统真空系统加速区进样系统离子源质量分析器检测器

质谱计框图IonisationsourceDetectorOutputIonseparation2021/4/269离子源质量过滤/分析器检测器进样部分样品板LC或GCEI源FAB源MALDI源ESI源QuadruopoleIontrapTime-of-flight电子倍增器闪烁计数器

+++++++++++++++++++++++++++++++++++++2021/4/2610离子源和质量分析器的真空度需保持在

10–4~10–5Pa和10–5~10–6Pa。因为：大量氧会烧坏离子源的灯丝；用作加速离子的几千伏高压会引起放电；引起额外的离子－分子反应，改变裂解模型，谱图复杂化。质谱计构造:真空系统2021/4/2611在不破坏真空度的情况下，使样品进入离子源。气体可通过储气器进入离子源。易挥发的液体，在进样系统内汽化后进入离子源。难挥发的液体或固体样品，通过探针直接插入离子源。进样系统9、人的价值，在招收诱惑的一瞬间被决定。2023/2/32023/2/3Friday,February3,202310、低头要有勇气，抬头要有低气。2023/2/32023/2/32023/2/32/3/20235:02:36PM11、人总是珍惜为得到。2023/2/32023/2/32023/2/3Feb-2303-Feb-2312、人乱于心，不宽余请。2023/2/32023/2/32023/2/3Friday,February3,202313、生气是拿别人做错的事来惩罚自己。2023/2/32023/2/32023/2/32023/2/32/3/202314、抱最大的希望，作最大的努力。03二月20232023/2/32023/2/32023/2/315、一个人炫耀什么，说明他内心缺少什么。。二月232023/2/32023/2/32023/2/32/3/202316、业余生活要有意义，不要越轨。2023/2/32023/2/303February202317、一个人即使已登上顶峰，也仍要自强不息。2023/2/32023/2/32023/2/32023/2/32021/4/2613SampleIntroduction:（直接进样杆）

DirectInsertionProbe(DIP)DirectinsertionprobeConceptuallyveryeasy,practicallyverytricky2021/4/2614SampleIntroduction:

GasChromatogram-MS(GC-MS)GCoutputtomassspectrometerSamplealreadyingasphase2021/4/2615SampleIntroduction:

LiquidChromatogram-MS(LC-MS)DirectinfusionofsampleinsolutionSyringepump:slowsteadyinfusionOutputfromHPLCSeparationandidentificationofcomponentsVastmajorityofsolutionissolventMustremovesolventto“see”analyteHistorically:extrapumpingandheatingApplicabletoelectrosprayionisationESI:seelater2021/4/2616分子失去电子，生成带正电荷的分子离子分子离子可进一步裂解，生成质量更小的碎片离子

+.M+.A

++B+CD++.中性分子或碎片

R.M+eM+.+2eM-.小于1%50-70eV离子源2021/4/2617◆质量分析器是质谱计的核心◆不同类型的质量分析器构成不同类型的质谱计◆不同类型的质谱计其功能，应用范围，原理，实验方法均有所不同。

质量分析器2021/4/2618检测记录系统

质量分析器分离并加以聚焦的离子束，按m/z的大小依次通过狭缝，到达收集器。经接收放大后被记录。2021/4/2619电子轰击电离

ElectronImpactIonization,EI化学离子化

ChemicalIonization,CI场电离，场解吸FieldIonizationFD,FieldDesorptionFD快原子轰击FastAtomBombardment,FAB基质辅助激光解析电离Matrix-AssistedLaserDesorptionIonization,MALDI电喷雾电离ElectrosprayIonization,ESI大气压化学电离AtmosphericPressureChemicalIonization,APCI离子化的方法2021/4/2620++++:R1:R2:R3:R4:e+M+(M-R2)+(M-R3)+MassSpectrometer(M-R1)+电子轰击电离

ElectronImpact（EI）2021/4/2621电子轰击电离又称为电子轰击，或电子电离。是应用最普遍，发展最成熟的电离方法。轰击电压50-70eV,有机分子的电离电位一般为7-15eV。可提供丰富的结构信息。灵敏度高，能检测纳克(ng)级样品；有些化合物的分子离子不出现或很弱电子轰击电离EI2021/4/2622基质辅助激光解吸电离(MALDI)基本原理：将样品分散在基质分子中并形成共结晶后直接进样,当用激光(337nm的氮激光或355nm的固体激光器)照射晶体时,基质吸收了激光的大部分能量，使基质分子和样品获得能量投射到气相并得到电离，成为带电荷的离子。因此基质在样品离子形成过程中起到了质子化或去质子化的作用，使样品分子带上正电荷或负电荷，成为带电荷的离子。离子源特点:1、使用脉冲式激光；

2、产生单电荷离子和部分双单电荷离子，质谱图中的谱峰与样品各组分的质量数有一一对应关系；

3、离子化效率高，灵敏度高(fmol～amol)常用基质：芥子酸(3,5-二甲氧基-4-羟基肉桂酸)（SA)、龙胆酸(2,5-二羟基苯甲酸)(DHB)、α-氰基-4-羟基肉桂酸(CHCA)、吡啶甲酸(PA)、3-羟基吡啶甲酸(3HPA)。2021/4/2623MALDI技术中基质的作用把样品分子彼此分开(基质：样品=10，000：1)，削弱样品分子之间的相互作用。基质吸收激光的能量，并将部分能量传递给样品。帮助样品离子化。C:MALDI激光解吸附离子源

Matrix-AssistedlaserDesorption/IonizationMALDI源的出现解决了生物大分子的离子化难题，离子化过程与FBI有相似之处。1、使用基质，但基质为固体。2、MALDI用脉冲激光束轰击样品和基质的共结晶。对基质的要求是能吸收337nm紫外光并气化，能量由基质传给样品使样品一起气化并离子化。2021/4/26252021/4/26262021/4/2627常用基质1、α氰基－4羟基－肉桂酸CCA多肽2、3,5－二甲氧基－4－羟基肉桂酸SA蛋白3、龙胆酸（2,5－二羟基苯甲酸DHB聚合物4、吡啶甲酸PA5、3－羟基吡啶甲酸3HPAMALDI源由氮激光器产生短周期脉冲激光，产生的多为单电荷离子，效率很高，即使只有极少的样品也可分析2021/4/2628常用基质结构DHBSACCA2021/4/2629MALDI的优缺点优点1、质量数可达300,000Da。2、attomole至femtomole级灵敏度。3、软电离方式，无或极少碎片离子。4、耐盐（样品含盐可达毫摩尔浓度）。5、适于分析复杂混合物。缺点1、分辨率低。2、1000Da以下基质峰干扰。3、激光解吸附离子化有可能使样品光降解。4、串联质谱功能较弱，除非接反射装置进行源后衰变测量。5、不能分析非共价键相互作用。6、定量时需要内校准。7、如没有反射飞行装置，不能分析多肽修饰。8、对各种赋形剂的容忍度低（如含磷酸缓冲液，大于150mM的盐等。D:ESI离子源

ElectrosprayIonization4000v强电场中，样品溶液通过毛细管喷嘴喷出，带电液滴被静电场吸向质谱人口，同时伴随干燥或加热干燥气体吹送，使液滴表面溶剂挥发,液滴体积变小，表面电荷密度变大，当同种电荷之间的库仑斥力达到雷利极限时，突破表面张力，液滴爆裂为更小的带电液滴，这一过程不断重复，使最终的液滴非常细小，呈喷雾状，此时液滴表面电场非常强大，使分析物离子化，带单电荷或多电荷。一般分析物分子量<2000Da带单电荷或双电荷

>2000Da带多电荷2021/4/2632NANO-ESI喷雾照片2021/4/2633ESI特点1、ESI产生的生物大分子离子如多肽蛋白等常常带10个以上电荷，使得m/z大大减小，弥补了四极杆质量分析器等质量范围窄的缺点。2、质谱图显示的是离子带不同电荷数的一系列质荷比峰，根据峰位置换算成质量数和电荷数。2021/4/2634ESI优缺点优点1、质量数可达70，000Da2、灵敏度高达femtomole级。3、软电离，可观察生物分子非共价反应。4、易于和LC串联，直接分析流速为1ml/min的LC洗脱液。5、没有基质干扰。6、适于联四极杆质量分析器、离子阱质量分析器做结构分析。7、带多电荷，允许质量范围窄的设备检测高质量数的离子。8、带多电荷，通过计算平均值给出更精确的质量数。9、特别适于测多肽的修饰。10、样品前处理简单可直接分析RP-HPLC脱盐处理的溶液。缺点1、耐盐能力低。2、对某些化合物特别敏感，污染难清洗。3、样品需先气化，混合物不适用。4、带多电荷，在分析混合物时，产生混乱。5、定量时需内校准。2021/4/2635质谱计质量分析器的主要技术指标

1、质量范围：指质谱计所检测的单电荷离子的质核比范围2、分辨率（R）：分辨率是质谱计分开相邻两离子质量的能力。

分辨率（R）是两峰间的峰谷为峰高的10%时的测定值，即两峰各以5%的高度重叠。R=m/m

m为质谱计可分辨的相邻两峰的质量差m为可分辨的相邻两峰的平均质量3、灵敏度：

质量分析器（过滤器）2021/4/2636例:有质量数为200和201的两峰，使之正好分开（满足10%谷的要求），需要仪器的分辨率达到：

R=m/m=200/（201-200）=200若要分开1000和1001两个离子，所需仪器的分辨率应该为R=m/m=1000/（1001-1000）=1000可见分离质量数愈大的离子所需的分辨率愈高。2021/4/2637不同分辨率谱图效果2021/4/26383、灵敏度：仪器对样品在量的方面的检测能力。绝对灵敏度：在记录仪上得到可检测的质谱信号所需的样品量(g)；相对灵敏度：可检测到的微量杂质的最小浓度(如μg·ml-1)。；2021/4/2639CONTENT目录质谱仪的分类2021/4/2640根据质量分析器的工作原理，常见的质谱仪可以分为：磁偏转飞行时间四极杆离子阱傅立叶变换串联质谱仪：时间串联、空间串联2021/4/2641E=U·z=1/2mv2

和

t=L/V

E：离子在加速电场获得的动能;U：加速电场电压z：离子所带电荷;m：离子质量v：离子飞行速度;L：飞行管道长度t：离子飞行时间;c：常数质量分析范围：500Da---100KDaMALDI-TOF质谱的原理t=c·m/z2021/4/2642Pulsedlaser多肽离子在TOF管里飞行，飞行速度取决于多肽离子的M/Z的大小Flighttube1：基质与多肽样本共同置于刚靶上。HighvacuumTimeHighvoltage2.样本被激光电离形成多肽离子混合物。20-25kV5.检测到每个离子的M/Z后，同一张图谱上计算机输出每个肽段M/Z，即蛋白质的多肽图谱，通过与理论数据库中的肽图片比对，从而鉴定蛋白。4.到达检测器的离子，通过检测器检测出每个肽段离子的M/Z.1.3MALDI-TOF-MS质谱的分析步骤2021/4/2643LaserMALDI-TOF-MS线性模式检测Sample

plateAnalytemolecules

inmatrixAccelerationgridsDrifttubeIondetectorMassspectrumVacuumsystemVacuum

lock几秒钟即可得到结果2021/4/2644应用MALDI-TOF-MS技术鉴定和分类微生物2021/4/2645一个单四极杆质谱仪2021/4/2646四极杆质量过滤器合成电压在两个对杆上数量是相同的，极性是相反的。2021/4/2647四极杆质量过滤器如何工作的？2021/4/2648空间串联多级质谱：QQQ•必须通过连续放置多个分析器来实现空间串联的多级质谱分析。•

对于QQQ，每个分析器有以下单独的作用：

–第一个四极杆(Q1)根据设定的质荷比范围扫描和选择所需的离子。–第二个四极杆(Q2)，也称碰撞池，用于聚集和传送离子。在所选择离子的飞行途中，引入碰撞气体，例如氮气等。–第三个四极杆(Q3)用于分析在碰撞池中产生的碎片离子。2021/4/2649QQQ多级质谱：多反应监测Q1选择某一质量的母离子，碰撞单元产生碎片离子。Q3用于搜寻多个选择反应监测，这就是多重反应监测（MRM）。2021/4/2650三重四极杆:SRM或MRM2021/4/2651CONTENT目录质谱在医学检验中的应用2021/4/26521234新生儿遗传代谢性疾病筛查氨基酸检测治疗药物浓度监测其他，如维生素D、叶酸、应用范围2021/4/26531新生儿遗传代谢性疾病筛查自1902年英国Garrod教授发现尿黑酸尿症以来，先天性代谢性疾病逐渐被认知。1909年，Garrod提出遗传代谢性疾病(inheritedmetabolicdiseases，IMD)的概念，至今已发现逾1000种各类IMD，总体发病率高达1：800。许多IMD可以通过饮食干预、相应代谢物替代治疗、去除毒性代谢产物等手段进行疾病的预防干预和治疗。从新生儿开始对IMD进行及时、正确的干预治疗可以有效阻断疾病进展造成永久性损伤，防止发育畸形、智力障碍、甚至死亡的发生。2021/4/2654常见IMD的分类1）氨基酸代谢异常苯丙酮尿症、枫糖尿病、高甲硫氨酸血症等。2）有机酸代谢异常3）脂肪酸代谢异常4）其他甲基丙二酸血症、丙酸血症等。肉碱转运障碍、中链酰基辅酶A脱氢酶缺乏症等尿酸循环障碍、线粒体病等2021/4/2655苯丙酮尿症病因苯丙氨酸是人体必需的氨基酸之一，2/3苯丙氨酸则过肝细胞中苯丙氨酸羟化酶（PAH）的转化为酪氨酸，以合成甲状腺素、肾上腺素和黑色素等。基因突变有可能造成相关酶的活性缺陷，致使苯丙氨酸发生异常累积。2021/4/26562021/4/2657临床表现1.生长发育迟缓除躯体生长发育迟缓外，主要表现在智力发育迟缓。表现在智商低于同龄正常儿，语言发育障碍尤为明显，这些表现提示大脑发育障碍。2.神经精神表现由于有脑萎缩而有小脑畸形，反复发作的抽搐，但随年龄增大而减轻。肌张力增高，反射亢进。常有兴奋不安、多动和异常行为。3.皮肤毛发表现皮肤常干燥，易有湿疹和皮肤划痕症。由于酪氨酸酶受抑，使黑色素合成减少，故患儿毛发色淡而呈棕色。4.其他由于苯丙氨酸羟化酶缺乏，苯丙氨酸从另一通路产生苯乳酸和苯乙酸增多，从汗液和尿中排出而有霉臭味（或鼠气味）。2021/4/2658病因学：此症为一先天性氨基酸代谢异常疾病，因基因突变造成将甲硫氨酸(methionine)转化成S-腺甘甲硫酸氨(S-adenosylmethionine；简称AdoMet)所需的酵素功能缺乏，此酵素称为methionineadenosyltransferase，MAT，会导致血液中的甲硫氨酸堆积并升高。此种甲硫氨酸升高并非因为高胱胺酸尿症(homocystinuria)、第一型酪氨酸血症(tyrosinemia)及肝脏疾病引起的，却仍然持续出现高甲硫氨酸现象的病症，所以被定义为高甲硫氨酸血症，又称为MAT缺乏症。甲硫氨酸参考值(μmol/L):7-552021/4/2659临床上表征：

大部分的患者的MAT酶还有些许残余的功能，酶活性只是部分不活化，所以多属于良性，一般而言没有明显之症状。但也有文献报告少部分的患者被发现有肌张力低下

、心智迟缓及迟发性的神经脱髓鞘(delayeddemyelization)等神经学的症状，则是因为属于MAT完全缺乏者。

2021/4/26602021/4/2661酪氨酸血症Tyrosinemia2021/4/26622021/4/2663血液中升高的酪氨酸水平可源于三种酪氨酸代谢遗传疾病。酪氨酸血症I型于1957年被报道，由于缺乏延胡索酰乙酰乙酸水解酶（FAH）所致。患者以加拿大魁北克省法裔或斯堪的纳维亚人占绝大多数，其他族裔也有病例发现。本病发病率约为1/100000加拿大魁北克法裔人群发病率很高,可达1/2000酪氨酸血症II型，也称为眼皮肤酪暗锁血症，特症为影响角膜和皮肤，由于缺乏作用于酪氨酸分解的第一步的酪氨酸转氨酶所致。酪氨酸血症II型于1973年被报道，患者绝大多数是意大利人，其他族裔也有病例发现。酪氨酸血症III型是一种罕见的代谢病，由于缺乏4－羟基苯丙酮酸二氧化酶（4HPPD）所致，仅有少数病例被报道。除了这三种遗传疾病，暂时性酪氨酸血症是新生儿筛查时酪氨酸浓度升高的主要原因。2021/4/26642氨基酸检测2021/4/2665目标化合物中文名称Level1对照（平均浓度µmol/L）%CVLevel1对照（平均浓度µmol/L）%CVAlanine丙胺酸362.25.75633.74.10Alanine(byMRM)丙胺酸340.45.26606.63.32Arginine精氨酸18.71.8093.65.24Asparticacid天冬氨酸142.07.80265.34.82Citrulline瓜氨酸58.06.12218.23.87Glutamicacid谷氨酸432.56.07798.64.39Glycine氨基乙酸391.15.401125.83.16Leucine亮氨酸224.47.204584.29Methionine甲硫氨酸53.76.68195.64.25Methionine(byMRM)甲硫氨酸53.95.71200.53.42Ornithine鸟氨酸212.55.98602.74.41Phenylalanine苯基丙氨酸123.94.97482.14.10Tyrosine酪氨酸159.06.89438.94.64Valine缬氨酸236.65.89427.85.03Carnitine肉毒碱65.610.1128.79.87C2-CarnitineC2-肉毒碱47.65.4687.95.45C3-CarnitineC3-肉毒碱7.5710.6115.078.13C4-CarnitineC4-肉毒碱1.2811.844.158.44C5-CarnitineC5-肉毒碱0.6813.122.3810.92C5-DC-CarnitineC5-DC-肉毒碱0.3212.552.4913.27C6-CarnitineC6-肉毒碱0.5412.732.088.72C8-CarnitineC8-肉毒碱0.6315.532.146.86C10-CarnitineC10-肉毒碱0.668.752.056.29C12-CarnitineC12-肉毒碱0.7111.712.238.41C14-CarnitineC14-肉毒碱0.5919.462.088.40C16-CarnitineC16-肉毒碱4.7410.0511.46.70C18-CarnitineC18-肉毒碱2.549.587.38.372021/4/26662021/4/2667临床意义：游离氨基酸是一类非常重要的体内标志物。除了作为新生儿代谢疾病的标志物之外，氨基酸还跟众多的临床疾病有直接的关联。比如，肾病患者，其血液游离氨基酸增加，慢性肾炎和尿毒症患者Val/Gay、Try/Phe比例降低，慢性肾炎患者尿液中游离氨基酸升高。而兴奋性氨基酸谷氨酸，谷氨酰胺（Glu，Gln)天冬氨酸（Asp）；抑制性氨基酸:甘氨酸（Gly）7-氨基丁酸（GABA）牛磺酸（Tau）这些氨基酸的含量变化跟很多神经系统疾病息息相关。2021/4/26683治疗药物浓度监测需要进行监测的药效学和药动学原因1.安全范围窄，治疗指数低一些药物治疗浓度和最小中毒浓度接近甚至重叠，极易中毒，只有通过TDM调整剂量，才能既保证疗效又不致产生毒性；2.以控制疾病发作或复发为目的的用药此类用药多需数月或数年的长期用药，如果不进行TDM，临床只能根据病症是否出现或复发、毒性反应是否发生为调整剂量的依据。而一旦发生上述情况再调整剂量，将导致不必要的经济损失或延误病情，甚至不可逆的后果；3.不同治疗目的需不同的血药浓度；4.药物过量中毒；5.药物治疗无效原因查找；6.已知治疗浓度范围内存在消除动力学方式转换的药物；7.首过消除强及生物利用度差异大的药物；2021/4/2669TDM的临床应用和意义1.监督临床用药，制定合理的给药方案，确定最佳治疗剂量，保证个体化给药，提高疗效和减少不良反应。2.研究与确定常用剂量情况下，不产生疗效或出现意外毒性反应的原因。3.确定患者是否按照医嘱服药。2021/4/2670分

类临床使用的代表药物强心甙地高辛、洋地黄毒甙、毒毛花苷K、西地兰抗心律失常药奎尼丁、利多卡因、普鲁卡因、胺碘酮抗癫痫药苯妥英钠、苯巴比妥、卡马西平、扑米酮、丙戊酸钠、乙琥胺、加巴喷丁、拉莫三嗪、非氨酯、托吡酯、氨己烯酸、唑泥沙胺、奥卡西平、泰加平、左乙拉西等抗抑郁药丙米嗪、地昔帕明、阿米替林、多虑平等抗精神病药氯氮平抗躁狂症药碳酸锂免疫抑制药环孢素A、他克莫司、霉酚酸、西罗莫司、咪唑立宾平喘药氨茶碱β受体阻断剂普萘洛尔、阿替洛尔、美托洛尔等抗生素

氨基甙类（庆大霉素、卡那霉素、妥布霉素、链霉素、阿米卡星）、万古霉素、氯霉素、两性霉素B等抗恶性肿瘤药甲氨蝶呤、环磷酰胺、阿霉素、顺铂等抗结核药异烟肼、利福平、吡嗪酰胺抗病毒药沙奎那韦、英地那韦、奈非那韦抗真菌药伊曲康唑、酮康唑2021/4/2671液质临床常用检验项目单次单项目最低收费（元）单次试剂耗材成本（元）单次检测时间(min)移植科免疫抑制剂血药浓度快速测定200／项/次，一般联合用药2个左右；400元/次304min2021/4/26721,5-脱水葡糖醇