放射免疫法和ELISA之间的差异

放射免疫法和ELISA之间的差别

付涛（2012881007）2023/2/3浙江万里学院放射免疫法一、原理：利用放射性同位素标记抗原或抗体，然后与被测的抗体或抗原结合，形成抗原抗体复合物的原理来进行分析的。2023/2/3浙江万里学院分析方法放射免疫法分析有两种方法：竞争性RIA,又称传统RIA非竞争性RIA，又称免疫放射分析（IRMA)2023/2/3浙江万里学院竞争性RIA

主要特点：标记的是抗原。其原理：未知抗原Ag+标记抗原Ag＊+已知定量抗体Ab标记抗原与抗体复合物Ag＊Ab+未知抗原与抗体复合物AgAb+游离标记抗原Ag＊（去除）。2023/2/3浙江万里学院基本原理Ag-Ab+Ag*AgAbAg++*Ag-Ab+

*Ag(B)复合物(F)游离物

*Ag与Ag的免疫活性相同*Ag＋Ag>

AbAg=*Ag,AgAb=*AgAbAg>*Ag,*AgAb(B)*Ag(F)Ag<*Ag,*AgAb(B)*Ag(F)2023/2/3浙江万里学院Ag*AgAb*AgAbAgAb*Ag++++++++++++++++++++2023/2/3浙江万里学院Ag2550100200400800*AgAb分离B、FB%=B/(B+F)F%=F/(B+F)R=B/FB1%B2%B3%B4%B5%B6%123456浓度2023/2/3浙江万里学院B%标准曲线2023/2/3浙江万里学院在体外条件下,Ag与定量的*Ag对限量的特异性Ab的竞争结合反应。B%F%B/F1.02.0CalibrationCurve602023/2/3浙江万里学院（一）基本试剂1、抗体2、标记抗原3、非标记抗原（标准品）二、基本方法化学结构、免疫活性与被测抗原相同高纯度2023/2/3浙江万里学院1、抗体1）亲合常数K（affinityconstantK）反应抗体与抗原的结合能力2）交叉反应率反应抗体的specificity

3）滴度(titer)抗体的稀释倍数

B/F0.51.0复合物浓度123·····斜率=-K10100100010000100000Ab稀释度工作滴度高亲和力高特异性高滴度Scatchard作图2023/2/3浙江万里学院2、标记抗原1）比活度和放化纯度足够高比活度——每微克抗原上标记放射性核素的千贝可数（KBq/μg）放化纯度——具有免疫活性的标记抗原占总放射性的百分数。>90%2）半衰期足够长3）保持原有抗原的特性125I—大分子、3Hor125I—小分子2023/2/3浙江万里学院（二）B和F的分离1、第一类2、第二类双抗体沉淀法PEG沉淀法固相第二抗体法二、基本方法+AgAb(1)Ab(2)试管Ab(2)Ab(1)Ag可溶性复合物可沉淀复合物2023/2/3浙江万里学院三、质量控制（qualitycontrol）1、精密度（precision）

变异系数（CV）2、准确度（accuracy）

回收率=测定值/真实值×100%90%~110%

3、灵敏度（sensitivity）方法的最小可测量4、特异性（specificity）交叉反应率5、可靠性（validity）平行性试验6、稳定性（stability）B0%，NSB，ED25，ED50，ED75

ABC2023/2/3浙江万里学院RIA小结灵敏度高特异性好精确的定量方法操作简便2023/2/3浙江万里学院非竞争性RIA（MISA)主要特点：标记的是抗体。按反应原理又分两种：单位点IRMA,其原理：抗原只有一个抗原决定簇，所测的抗原为小分子抗原。双位点IRMA：抗原有两个抗原决定簇，所使用的两种亚型抗体在与同一抗原分子结合时互不干扰。2023/2/3浙江万里学院免疫放射分析法*Ab+Ag-*Ab

+

*Ab（immunoradiometricassay,IRMA）B%Ag（B）（F）2023/2/3浙江万里学院

IRMA与RIA工作原理的主要区别RIAIRMA竞争性抗原抗体结合反应非竞争性抗原抗体结合反应采用标记抗原采用标记抗体三种主要反应试剂二种主要反应试剂所用抗体是限量的所用抗体是过量的*AgAb的量与待测Ag的量呈负相关Ag*Ab的量与待测Ag的量呈正相关反应到达平衡慢反应到达平衡快非特异结合主要影响高剂量区非特异结合主要影响低剂量区低剂量区有不确定因素低剂量区无不确定因素2023/2/3浙江万里学院ELISAELISA即酶联免疫吸附测定。其基本原理有三条：

（1）抗原或抗体能以物理性地吸附于固相载体表面，可能是蛋白和聚苯乙烯表面间的疏水性部分相互吸附，并保持其免疫学活性；

（2）抗原或抗体可通过共价键与酶连接形成酶结合物，而此种酶结合物仍能保持其免疫学和酶学活性；

（3）酶结合物与相应抗原或抗体结合后，可根据加入底物的颜色反应来判定是否有免疫反应的存在，而且颜色反应的深浅是与标本中相应抗原或抗体的量成正比例的，因此，可以按底物显色的程度显示试验结果。2023/2/3浙江万里学院ELISA过程包括：抗原（抗体）吸附在固相载体上称为包被，加待测抗体（抗原）,再加相应酶标记抗体（抗原）,生成抗原（抗体）－－待测抗体（抗原）－－酶标记抗体的复合物，再与该酶的底物反应生成有色产物。借助分光光度计的光吸收计算抗体（抗原）的量。待测抗体（抗原）的定量与有色产生成正比。2023/2/3浙江万里学院ELISA常用的四种方法

1．直接法测定抗原

1、将抗原吸附在载体表面；2、加酶标抗体，形成抗原—抗体复合物；3、加底物。底物的降解量＝抗原量。

2．间接法测定抗体1、将抗原吸附于固相载体表面；2、

加抗体,形成抗原-抗体复合物；3、加酶标抗体；4、加底物。测定底物的降解量＝抗体量。

2023/2/3浙江万里学院间接法洗涤洗涤洗涤待测抗体酶标抗抗体2023/2/3浙江万里学院3.双抗体夹心法测定抗原1、将抗原免疫第一种动物获得的抗体吸附于固相表面;2、加抗原，形成抗原-抗体复合物;3、加抗原免疫第二种动物获得的抗体，形成抗体抗原抗体复合物;4、加酶标抗抗体（第二种动物抗体的抗体）;5、加底物。底物的降解量＝抗原量。2023/2/3浙江万里学院双抗体夹心法洗涤洗涤洗涤待测抗原2023/2/3浙江万里学院

4.竞争法测定抗原（1）将抗体吸附在固相载体表面;（2）加入酶标抗原（3）加入酶标抗原和待测抗原；（4)加底物。

对照孔与样品孔底物降解量的差＝未知抗原量。

2023/2/3浙江万里学院竞争法洗涤洗涤待测抗原酶标抗原2023/2/3浙江万里学院ELISA实验步骤2023/2/3浙江万里学院洗板步骤每空加洗涤液350ul，30秒甩甩尽孔内液体，吸水纸上拍干尽孔内液体，吸水纸上拍干重复3次2023/2/3浙江万里学院ELISA实验结果分析标准品和标本的OD值减去空白孔的OD值绘制标准曲线，查出标本浓度2023/2/3浙江万里学院放射免疫法和ELISA之间的差别

1)放射免疫分析通过放射活性分子共价交联至抗体或抗原上，免疫反应后测定放射活性分子的放射信号来定量检测相应抗体或抗原等，可用于测定包括病毒、细菌、寄生虫、肿瘤以及小分子药物等的多种抗原和抗体。由于该方法特异性好，灵敏度高，且仪器自动化，操作简便，样品制备简单等，因而自50年代末问世以来已在许多领域中得到广泛的应用。但该方法中操作人员需要接触放射性物质，会损害操作人员的身体，同时测定完成后放射性材料的处置也是个严重的问题。2023/2/3浙江万里学院总结

2)酶免疫分析是将抗原、抗体的特异性免疫反应和酶的高效催化作用有机结合起来的一种免疫分析方法。将特定的酶标记在抗原或抗体上，在免疫反应后，通