A郑色谱分离技术的演变和发展

色谱分离技术的演变和发展作者：郑组员：胡毕姚谭实验前讨论：(1)什么是色谱分离技术？它经历怎样的发展、演变过程？

(2)简要说明色谱分析方法的基本原理，固定相和流动相的作用分别是什么？

(3)柱色谱的色谱柱如何进行填充？填充过程中需要注意哪些问题？

(4)简述柱色谱常用的洗脱剂及其洗脱能力的次序，如何选择合适的洗脱剂？采用柱色谱分离甲基橙和次甲基蓝混合染料时，为什么先用95%乙醇溶液作为洗脱剂，再用去离子水做洗脱剂进行洗脱，如果两者换一下次序是否可以？为什么？

什么是色谱分离技术?色谱分离技术又称层析分离技术或色层分离技术，是一种分离复杂混合物中各个组分的有效方法。它是利用不同物质在由固定相和流动相构成的体系中具有不同的分配系数，当两相作相对运动时，这些物质随流动相一起运动，并在两相间进行反复多次的分配，从而使各物质达到分离。色谱技术的发展和演变1色谱的起源2分配色谱的出现和色谱方法的普及3气相色谱和色谱理论的出现4高效液相色谱将一滴含有混合色素的溶液滴在一块布或纸片上,随着溶液展开可以观察到一个个同心圆环出现，古代罗马人就是用这种简单方法来分析燃料与色素。大约在100多年前，德国化学家Runge对该方法做了重要改进，使其有更好的重现性和定量能力。这项技术后来就发展成了今天的纸上色谱技术。到了20世纪初,1906年俄国植物学家米哈伊尔.茨维特用碳酸钙填充竖立的玻璃管,以石油醚洗脱植物色素的提取液,一段时间后,植物色素在碳酸钙柱中分离,以一条色带分散为数条平行的色带,这一实验将混合的色素分离为不同的色带,因此茨维特将这一方法命名为色普法（Chromatography）,色谱分离法创立时没有引起人们的注意，直到30年代后才被广泛使用。起源分配色谱的出现和色谱方法的普及1938年阿切尔•约翰•波特•马丁和理查德•劳伦斯•米林顿•辛格准备利用氨基酸在水和有机溶剂中的溶解度差异分离不同种类的氨基酸，马丁早期曾经设计了逆流萃取系统以分离维生素，马丁和辛格准备用两种逆向流动的溶剂分离氨基酸，但是没有获得成功。后来他们将水吸附在固相的硅胶上，以氯仿冲洗，成功地分离了氨基酸，这就是现在常用的分配色谱。在获得成功之后，马丁和辛格的方法被广泛应用于各种有机物的分离。1943年马丁以及辛格又发明了在蒸汽饱和环境下进行的纸色谱法。气相色谱和色谱理论的出现1952年马丁和詹姆斯提出用气体作为流动相进行色谱分离的想法，他们用硅藻土吸附的硅酮油作为固定相，用氮气作为流动相分离若干种小分子量挥发性有机酸。气相色谱的出现使色谱技术从最初的定性分离手段进一步演化为具有分离功能的定量测定手段，并且极大的刺激了色谱技术和理论的发展。相比于早期的液相色谱，以气体为流动相的色谱对设备的要求更高，这促进了色谱技术的机械化、标准化和自动化；气相色谱需要特殊和更灵敏的检测装置，这促进了检测器的开发；而气相色谱的标准化又使得色谱学理论得以形成色谱学理论中有着重要地位的塔板理论和VanDeemter方程，以及保留时间、保留指数、峰宽等概念都是在研究气相色谱行为的过程中形成的。高效液相色谱1960年代，为了分离蛋白质、核酸等不易汽化的大分子物质，气相色谱的理论和方法被重新引入经典液相色谱。1960年代末科克兰、哈伯、荷瓦斯、莆黑斯、里普斯克等人开发了世界上第一台高效液相色谱仪，开启了高效液相色谱的时代。高效液相色谱使用粒径更细的固定相填充色谱柱，提高色谱柱的塔板数，以高压驱动流动相，使得经典液相色谱需要数日乃至数月完成的分离工作得以在几个小时甚至几十分钟内完成。1971年科克兰等人出版了《液相色谱的现代实践》一书，标志着高效液相色谱法(HPLC)正式建立。在此后的时间里，高效液相色谱成为最为常用的分离和检测手段，在有机化学、生物化学、医学、药物开发与检测、化工、食品科学、环境监测、商检和法检等方面都有广泛的应用。高效液相色谱同时还极大的刺激了固定相材料、检测技术、数据处理技术以及色谱理论的发展。固定相和流动相的作用固定相指色谱过程中不移动的具有吸附活性的固体，柱色谱和平板色谱中既起分离作用又不移动的那一项（如茨维特实验中细粒状碳酸钙）或是涂渍在载体表面上的液体（称固定液）。流动相是指色谱分析过程中携带组分向前移动的物质，与固定相处于平衡状态，带动样品进行移动的那一项（如茨维特实验中石油醚）。柱色谱中色谱柱的填充干法

装柱将吸附剂一次加入色谱柱，振动管壁使其均匀下沉，然后沿管壁缓缓加入洗脱剂；或在色谱柱下端出口处连接活塞，加入适量的洗脱剂，旋开活塞使洗脱剂缓缓滴出，然后自管顶缓缓加入吸附剂，使其均匀地润湿下沉，在管内形成松紧适度的吸附层。操作过程中应保持有充分的洗脱剂留在吸附层的上面。湿法装柱将吸附剂与洗脱剂混合，搅拌除去空气泡，徐徐倾入色谱柱中，然后加入洗脱剂将附着管壁的吸附剂洗下，使色谱柱面平整。等到填装吸附剂所用洗脱剂从色谱柱自然流下，液面和柱表面相平时，即加供试品液。柱色谱填充注意事项干法操作时应保持有充分的洗脱剂留在吸附层的上面。湿法等到填装吸附剂所用洗脱剂从色谱柱自然流下，液面和柱表面相平时，即可加供试品溶液。柱色谱常用的洗脱剂及其洗脱能力的次序，如何选择合适的洗脱剂？洗脱剂的洗脱能力有如下(极性)顺序：

己烷和石油醚＜环己烷＜四氯化碳＜三氯乙烯＜二硫化碳＜甲苯＜苯＜二氯甲烷＜氯仿＜乙醚＜乙酸乙酯＜丙酮＜丙醇＜乙醇＜甲醇＜水＜吡啶＜乙酸选择的洗脱剂极性不能大于样品中各组分的极性。否则样品组分在柱色谱中移动过快，不能建立吸附-洗脱平衡，影响分离效果。实际操作时，一般采用薄层色谱反复对比、选择柱色谱的洗脱剂。能在薄层色谱上将样品中各组分完全分开，即可作柱色谱洗脱剂。一般来说，洗脱剂都需要采用混合溶剂，利用强极性和弱极性溶剂复配而成。

采用柱色谱分离甲基橙和次甲基蓝混合染料时，为什么先用95%乙醇溶液作为洗脱剂，再用去离子水做洗脱剂进行洗脱，如果两者换一下次序是否可以？为什么？不可以,因为次甲基蓝可溶于乙醇,而甲基橙不溶于乙醇等有机溶剂,先用95%乙醇溶液洗脱可以使二者分离,而次甲基蓝和甲基橙都可溶于去离子水,使之充分溶解.两者次序不可以交换,因为若先使用去离子水,甲基橙和次甲基蓝都充分溶解,难以再进行分离.由于甲基橙和亚甲基蓝结构不同，极性也不同,根据相似相容原理,吸附剂对它们的吸附能力也不同,洗脱剂对他们的解析速度也不同,极性小吸附能力弱,解析速度快的次甲基蓝先被洗脱下来,而极性大,吸附能力强的,解析速度慢的甲基橙后被洗脱下来,从而使两种物质得以洗脱下来,本实验以氧化铝做为吸附剂,对于极性洗脱剂:去离子水大于95%的乙醇溶液,如果极性过大的话有可能,被一起洗脱下来实验目的

实验目的：

学习色谱法分离和鉴定化合物的原理和基本操作了解和掌握薄层吸附色谱展开剂、柱色谱中洗脱剂、植物色素的提取和分离试剂的选择原则。实验原理：层析分离是利用混合物的各组份随着流动的液体或气体（称流动相）通过另一种固定不动的固体或液体（称固定相）时，在两相中分配（选择性溶解）、吸附或其他亲和性能的差别，达到分离的目的。

实验原理:菠菜的叶片中含有叶绿素（包括叶绿素a和叶绿素b）、叶黄素及胡萝卜素等天然色素。可用丙酮提取。提取:叶绿素易溶于无水乙醇等有机溶剂中,可以用无水乙醇提取绿叶中的叶绿体色素.分离:不同叶绿体色素随层析液在滤纸上扩散速度不同,从而分离出来形成条带.实验材料:材料:新鲜绿叶(如菠菜绿叶),石油醚、丙酮、乙醇、碳酸钙用具:烘箱、纸层析滤纸、表面皿、培养皿、研钵、离心机等实验步骤:叶绿素的提取1取新鲜植物叶片(如菠菜叶)，用烘箱(48℃)烘干半个小时，研成粉末（加入少量碳酸钙）。取叶粉(约2g)放入小烧杯中，加入适量乙醇(约20-30毫升)，进行浸提。浸提过程中需用玻棒经常搅动，如气温过低亦可适当加热，待酒精呈深绿色时，将溶液过滤到另一烧杯或三角瓶中置暗中备用。2取少量浸提液用台式离心机3000转/分，离心2分钟，保留上清液（含有叶绿素）。实验步骤:3点样取准备好的滤纸条（2×20cm），将其一端剪去两侧，中间留一长约1.5cm，宽约0.5cm的窄条，并在滤纸剪口上方折叠出一条直线，作为画提取液细线的基准线。用毛细吸管沾少许滤液在折线上描绘4~5次。

实验步骤:4展开:将适量的层析液（分离液）倒入烧杯，将滤纸条画线一端朝下，轻轻插入层析液中，迅速用培养皿盖住烧杯。

无水乙醇作为溶剂提取；若考虑分离色素，最早的色素分离是采用硅胶，若用乙醇显然效果不好。而采用LH-20等材料，分离效果很好。聚酰胺等等5观察记录：待层析液上缘扩散至接近滤纸条顶端时，将滤纸条取出，风干。观察滤纸条上所出现的色素带及其颜色，并做好记录。

最后滤纸条上将分离出四条色素带，颜色从上往下分别是橙黄色、黄色、蓝绿色和黄绿色，四种色素分别是胡萝卜素、叶黄素、叶绿素a和叶绿素b。形成原因：层析液通过毛细作用扩散到色素线上时将色素溶解在层析液中，它们的溶解度是不一样的，层析液在纸上继续向前扩散的时候，会不断挥发，因此其溶剂量会不断减少，那么溶解度低的色素就会首先被析出呈现在纸上，而溶解度高的随着层析液继续往前扩散，在前面一点的地方析出。

至于为什么不会在相隔的两条带之间有色素，是因为层析液是缓慢减少的，而每一种色素其析出的浓度只有一个，所以只会形成一条带。而胡萝卜素会在最上方,是因为相似相容原理,胡萝卜素与石油醚的极性最相近,因此胡萝卜素在石油醚中溶解度最大,因此