第七章微生物遗传与基因工程

第七章微生物遗传与基因工程第一节微生物遗传有关概念1遗传性（inheritance）

生物的亲代传递给其子代一套遗传信息的特性遗传型（genotype）

生物体所携带的全部基因的总称有关概念2表型(phenotype)

具有一定遗传型的个体，在特定的外界环境中，通过生长和发育所表现出来的种种形态和生理特征的总和。饰度（modification)

同型遗传型的生物，在不同的外界条件下，会呈现不同的表型。变异（variation)

只有遗传性的改变，即生物体遗传物质结构上发生的变化，才称为变异。在群体中，自然发生变异的机率极低，但一旦发生后，却是稳定的和可遗传的。微生物不同于其他生物的生物学特性1

单细胞体制或多细胞而极少分化的体制营养体多数是单倍体多数能在一定成分的培养基上迅速生长繁殖在固体培养基上能从单个细胞通过无性繁殖方式形成菌体微生物不同于其他生物的生物学特性2代谢作用旺盛环境因素对于分散的细胞起均匀而直接的作用有性世代在较短时间内完成有最简单的类型，例如病毒

DNA

螺旋体DNA结

构模式真核生物和原核生物就遗传物质上的区别1

真核生物的遗传物质是DNA，原核生物的遗传物质是DNA或RNA；

真核生物的染色体由DNA及蛋白质构成，原核生物的染色体是单纯的DNA或RNA；真核生物和原核生物遗传物质上的区别2

真核生物的染色体不止一个，原核生物的染色体往往只有一个；

真核生物的许多染色体为核膜所包被，原核生物的染色体外无膜包围。1、DNA在真核生物中的存在状态染色体DNA就含量言，真核生物高于原核生物，高等动物和植物又高于真核类微生物。染色体外的DNA以细胞器内形式存在，常呈环状，数量只占染色体DNA的1%以下。2、DNA在原核生物中的存在状态染色体DNA细菌和放线菌的遗传物质是双链DNA病毒为DNA或RNA，双链或单链，线状或环状染色体外DNA即为细菌质粒软病毒

软病毒蛋白细菌染色体(左）和质粒（右）质粒存在的三种形态细菌质粒和真核生物细胞器DNA的共同点1、自体复制。2、一旦消失以后，后代细胞中不再出现3、它们的DNA只占染色体DNA的一小部分。细菌质粒和真核生物细胞器DNA的区别1、成分和结构简单，一般都是较小的环状DNA分子，并不和其他物质一起构成一些复杂的结构。2、功能更为多样化，可一般不是必需的。3、许多细菌质粒能通过细胞接触而自动地从一个细菌转移到另一个细菌，使两个细菌都带有此质粒。2、DNA的自体复制

定义：复制不是依靠细胞中酶的作用，而是指它的分子结构的特异性由它本身所决定的。经典实验：利用同位素标记方法在大肠杆菌中进行试验。密度梯度离心试验结果以及半保留复制模型大肠杆菌DNA复制放射自显影试验细菌遗传物质的特性1

细菌代表大肠杆菌和其他原核生物中的基因数基本接近根据其基因组大小所估计的基因数，即这些微生物基因组DNA绝大部分用于编码蛋白质、RNA,用作为复制起点、启动子、终止子和一些由调节蛋白识别和结合的位点等信号序列。

绝大部分原核生物不含内含子，遗传信息是连续而不中断的。大肠杆菌总共有2584个操纵子。操纵子中73%只含有1个基因，16.6%含2个基因，4.6%含3个基因，6%含有4或4个以上基因。如此多的操纵子与原核基因的表达大多采用转录调控有关，组成操纵子有极为方便的一面。

大肠杆菌中功能相关的RNA基因也串联在一起。如构成核糖核蛋白体的3种RNA基因转录在同一个转录产物16SrRNA-23SrRNA-5SrRNA中，三者比例为1：1：1。如它们不在同一转录产物中，则可造成3种RNA比例失调，影响细胞功能，或需要一个极为复杂、耗费巨大的调节机构来保证正常必须的1：1：1。细菌遗传物质的特性2大多数情况下，大肠杆菌结构基因在基因组中是单拷贝的，但编码rRNA的基因rrn往往是多拷贝的。反映了基因组经济而有效的结构。大肠杆菌有7个rRNA操纵子，其特征都与基因组的复制方向有关即按复制方向表达。其中6个分布在DNA的双向复制起点oric(83min处)附近，而不是在复制终点（33min）附近。复制起点处基因表达量几乎是复制终点同样基因的2倍，这有利于核糖体的快速组装，便于在急需蛋白质合成时细胞可以在短时间内有大量的核糖体生成。基因组的重复序列少而短。原核生物基因组有一定数量的重复序列，但比真核生物少得多，且重复序列短，一般位4～40bp。重复程度有的为10多次，多者达上1000次。大肠杆菌K12菌株的染色体物理图谱古菌的遗传特性1

古细菌詹氏甲烷球菌（Methanococcusjannaschii）分离自2600m深,2.63x107Pa(260大气压)，94oC的海底火山口附近。此菌的基因组全序列分析表明，几乎有一半的基因在现有的细菌和真菌基因数据库中找不到同源序列，只有40%左右的基因与其他二域生物具有同源性，其中有的类似于真细菌，有的类似于真核生物，有的就是两者的融合，是真细菌和真核生物特征的一种奇异结合体。古细菌基因组在结构上类似于细菌。胞内16SrRNA的碱基序列既不同于真细菌的16SrRNA碱基序列，也不同于真核生物。古菌具有特殊的与细菌不同而与真核生物相类似的基因转录和翻译系统，此系统不受利福平等抗生素抑制，且RNA聚合酶由多个亚基组成，核糖体30S亚单位的形状、tRNA结构、蛋白质合成的起始氨基酸，对各种抗生素的敏感性等都不同于细菌而类似于真核生物。古菌的遗传特性2

詹氏甲烷球菌环形染色体DNA大小为1.66x106bp,具有1682个编码蛋白质的ORF。功能相关的基因组成操纵子结构，共转录成一个多顺反子；有2个rRNA操纵子；有37个tRNA基因，基本上无内含子；无核膜。但负责信息传递功能的基因（复制、转录和翻译）则类似于真核生物，特别是转录起始系统与真核生物基本相同，而与细菌绝然不同。古细菌的RNA聚合酶在亚基组成和亚基序列上类同于真核生物的RNA聚合酶II和III,而不同于细菌的RNA聚合酶。相应的启动子结构也类同于真核生物，TATA-box序列都位于转录起始位点上游25-30核苷酸处，与细菌启动子的典型结构（-10和-35）不一样。古菌的翻译延长因子是EF-Ia和EF-2，而细菌中分别为EF-Tu和EF-G，氨酰tRNA合成酶基因，复制起始因子等均与真核生物相似。古菌另有5个组蛋白基因，其组蛋白的存在可能表明，虽然甲烷球菌基因图谱看来酷似细菌的基因图谱，但基因组本身在细胞内可能实际上是按典型的真核生物方式组成真正的染色体结构。生命三域的16SrRNA、18SrRNA的特征核苷酸序列特征核苷酸序列

序列位置

在三域的16SrRNA、18SrRNA中出现（%）

概率

细菌域

古菌域

真核生物域CACYYG315>9500CYAAYUNYG510>9500AAACUCAAA91010030AAACUUAAAG9100100100NUUAAUUCG960>9500YUYAAUUG960<1100100CAACCYYCR1110>9500UUCCCG1380>9500UCCCUG13800>95100CUCCUUG13900>950UACACACCG1400>990100CACACACCG140001000Y：任一嘧啶，R：任一嘌呤，N：任一嘌呤或嘧啶酵母菌的遗传特性

酵母是单细胞真核生物，已完成全基因组测序，基因组大小13.5x106bp，分布在16个不连续的染色体中。DNA与4种主要的组蛋白(H2A，H2B，H3和H4)结合成染色质(chromatin)的14bp核小体核心DNA，染色体DNA上有着丝粒(centromere)和端粒(telomere)，没有明显的操纵子结构，有间隔区或内含子序列。最显著的特点是高度重复，如tRNA基因在每个染色体上至少4个，多则30多个，共约有250个拷贝。基因组上有许多较高同源性的DNA重复序列，这是一种进化。即可在少数基因发生突变而失去功能时不会影响生命过程，也可适应复杂多变的环境，丰余的基因可在不同的环境种起用多个功能相同或相似的基因产物，有备无患。酵母菌确实比细菌和病毒进步而富有，而细菌和病毒似乎更聪明，能更经济更有效地利用遗传资源。基因突变一、突变类型依据表型改变分为：1、形态突变型：发生细胞形态变化或引起菌落形态改变的突变型。2、生化突变型：一类发生代谢途径变异但无明显形态变化的突变型。3、致死突变型：造成个体死亡或生活力下降的突变型，后者称为半致死突变型。4、条件致死突变型：在某一条件下具致死效应，而在另一条件下无致死效应的突变型。生化突变型分类

1、营养突变型：由基因突变而引起代谢过程中某酶合成能力丧失的突变型，它们必须在培养基中添加相应的营养成分才能正常生长。2、抗性突变型：一类能抵抗有害理化因素的突变型。根据其抵抗对象可分为抗药性、抗紫外线或抗噬菌体等突变类型。3、抗原突变型：指细胞成分尤其是细胞表面成分（细胞壁、荚膜、鞭毛）的细微变异而引起抗原性变化的突变型。突变的其他分类类型

依遗传物质的结构改变，分为：碱基置换，移码，DNA片段的缺失和插入

依突变引起的遗传信息的改变分为：同义突变，错义突变和无义突变第二节基因工程基因工程I基因工程是一种DNA的体外重组技术，是根据人们的需要，在分子水平上用人工方法取得供体DNA上的基因，在体外重组于载体DNA上，再移入原体细胞，使转录翻译及复制，表达出供体基因原有的生物学特性。

基因工程II这种使DNA分子进行重组，再在受体细胞内无性繁殖的技术也被称为分子无性繁殖或分子克隆。通过基因工程改造后的菌株被称为“工程菌”。基因工程主要步骤①分离或合成基因；②体外重组将基因插入载体；③重组DNA导入受体细胞；④基因克隆和筛选重组子；⑤克隆的基因进行鉴定或测序；⑥外源基因的表达和基因产物或转基因微生物、转基因动物、转基因植物的获得。基因工程的基本操作步骤21、目的基因的取得2、载体的选择3、目的基因与载体DNA的体外重组4、重组载体引入受体细胞

基因工程的操作步骤示意图目的基因的取得1）从适当的供体细胞的DNA中分离。2）通过逆转录酶的作用由mRNA合成cDNA。3）由化学方法合成特定功能的基因。一、微生物基因工程的工具酶

对DNA片段进行操作，必须要运用能“切短”DNA的得心应手的工具。工具酶就是对不同来源的DNA片段进行切割拼接组装。在分离目的基因或切割载体时，需利用特异的限制性核酸内切酶对DNA进行准确切割。在构建重组DNA时，需要DNA连接酶催化，使目的DNA片段与载体DNA进行连接。1、限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶（restrictionendonuclease）或简称为限制性酶（restrictionenzyme）是指能识别双链DNA分子的特定序列，并在识别位点或其附近切割DNA的一类内切酶。2、限制性核酸内切酶的分类

限制性核酸内切酶可分成三类：I类酶结合于识别位点并随机切割识别位点不远处的DNA。III类酶在识别位点上切割DNA分子，然后从底物上解离。以上二类酶兼有切割和修饰（甲基化）的作用，并依赖于ATP的存在。II类酶由二种酶组成，一种为限制性内切核酸酶，它切割某一特异的核苷酸序列；另一种为独立的甲基化酶，它修饰同一识别序列。至今已分离出600多种II类酶。限制性核酸内切酶EcoRI的作用

2、DNA连接酶将不同的DNA片段连接在一起的酶叫DNA连接酶。DNA连接酶主要来自T4噬菌体和大肠杆菌。DNA连接酶催化两个双链DNA片段相邻的5’端磷酸与3’端羟基之间形成磷酸二酯键。它既能催化双链DNA中单链切口的封闭，也能催化两个双链DNA片段进行连接。DNA连接酶主要有两种：一种是T4DNA连接酶，另一种是大肠杆菌DNA连接酶。T4DNA连接酶由一条多肽链组成，相对分子量为6800Da，通常催化粘性末端间的连接效率要比催化平末端连接效率为高。催化反应需要Mg2+和ATP，ATP作为反应的能量来源。T4DNA连接酶在基因工程操作中被广泛应用。大肠杆菌DNA连接酶的相对分子量为7500Da，连接反应的能量来源是NAD+，此酶催化DNA连接反应与T4DNA连接酶大致相同，但不能催化DNA分子的平端连接。体外DNA连接方法目前常用的三种：1）用T4或E.coliDNA连接酶可连接具有互补粘性末端的DNA片段；2）用T4DNA连接酶连接具有平末端DNA片段；3）先在DNA片段末端加上人工接头，使其形成粘性末端，然后再进行连接。二、微生物基因克隆载体克隆载体（cloningvector）是把一个有用的目的DNA片段通过重组DNA技术，送进受体细胞中去进行繁殖和表达的工具叫载体（vector）。作为克隆载体的基本要求：①

能进行独立自主复制；②

具有便于外源DNA的插入和限制酶作用的单一切割位点；③

必须具有可供选择的遗传标记，例如具有对抗生素的抗性基因，便于对阳性克隆的鉴别和筛选。基因工程中使用的载体基本上均来自微生物，主要包括6大类：质粒载体；λ噬菌体载体；柯斯质粒载体；M13噬菌体载体；真核细胞的克隆载体；人工染色体等。载体的选择I1）是一个有自我复制能力的复制子（replicon)2)能在受体细胞内大量增殖，即有较高的复制率。3）载体上最好只有一个限制性内切核酸酶的切口，使目的基因能固定地整合到载体DNA的一定位置上。4）载体上必须有一种选择遗传标记，以便及时将“工程菌”选择出来。载体的选择II有条件作为载体的，对原核受体细胞来说，主要有细菌质粒（松弛型）和λ噬菌体两类对真核微生物受体来说，主要有SV4O病毒SV4O病毒是猴体内小型环状双链DNA病毒对植物细胞受体来说，主要是Ti质粒第三节微生物酶学工程MicrobialEnzymologicalEngineering酶学工程酶学工程（enzymeengineering）是指从细胞和分子水平上对酶进行改造和加工，使酶最大限度地发挥其效率的过程。

一、酶的分离纯化对酶分子进行改造和加工，首先必须对酶进行分离纯化。分离：对胞内酶，先破碎细胞，然后用稀酸、稀碱或稀盐溶液将酶抽提出来，对胞外酶，用离心或过滤等方法去除沉淀物。纯化：这些抽提液或培养液经浓缩后，用层析、离心、凝胶过滤等方法纯化。由于酶很容易失活，操作时应尽可能温和，最好在低温（0℃~4oC）下进行。二、酶的分子改造由于酶是生物细胞产生的，因此其最适作用条件常常是常温、中性pH范围。但是在应用酶时，常是在体外的各种环境中，而这些环境常会引起酶的不稳定。即酶的产生条件与作用条件不一致。为此，需要对酶分子进行改造，使其能适应多方面的需要。对酶分子的改造一般有以下两种方法：1、分子修饰2、生物酶工程

1、分子修饰通过对主链的剪接切割和侧链的化学修饰来改造酶分子，如水解去除酶的部分非活性主链，利用修饰剂对酶分子上的某些侧链基团（尽可能选择非必需基团）进行共价修饰，辅酶因子的置换等，以提高酶活力，改进酶的稳定性和对环境的适应性。

2、生物酶工程通过遗传工程手段改造编码酶分子的基因从而达到改变酶分子的目的。可包括三个方面内容：①

用基因工程技术生产克隆酶－－酶的克隆是指用基因工程的方法将酶编码基因克隆至微生物受体中，使其在微生物中高效表达，并通过发酵大量生产的一种技术。②

修饰酶基因——酶基因的修饰是通过定向诱变改变基因的某几个碱基，使其编码的酶的部分氨基酸发生变化，从而改进酶性状的一种技术。③

设计出新酶基因，合成自然界中从未有过的酶。三、酶与细胞的固定化

酶是一种生物催化剂，稳定性较差，而且催化结束后难于收回。为此发展出了固定化技术。即用物理或化学方法将酶（或细胞）固定于某一限制性空间，并保持其固有的催化活性，使其活性能被反复利用的技术。尤其是对多酶反应体系来说，直接用固定化细胞可能更方便、更经济。

固定化方法1常用的制备方法有：载体结合法，交联法和包埋法等几大类。载体结合法是将酶或细胞通过物理吸附、离子吸附、螯合和共价结合等方式连接到载体上的固定化技术；交链法是通过双功能或多功能的交联剂，使酶或细胞与载体间形成共价结合的一种固定化技术包埋法是通过高分子凝胶网格或半透膜将酶或细胞固定的技术。固定化的细胞具有明显的特点：①

酶活力的稳定性增强；②

酶促效率明显升高；③

具有多步酶反应的特点；④

反应时不需添加辅助因子；⑤

细胞透性增强；⑥

热稳定性增强；⑦

易产生副反应。

固定化方法示意图2（1）离子结合法（2）共价结合法（3）交联法（4）聚合物包埋法（5）微胶囊法四、生物传感器

由于固定化酶或细胞具有稳定性好，能重复利用的优点，人们将它与化学或物理元件组装在一起，利用其催化特性来分析样品中的有机物质（酶的底物）。这种由生物学、医学、电化学、光学、热学等多学科相互渗透而成长起来的分析检测装置就是生物传感器，它具有选择性高、分析速度快、操作简单、价格低廉等特点，能进行连续在线分析。

将酶、细胞，甚至细胞器、组织或抗体固定于透性膜上构成生物敏感膜。待测物质经扩散作用进入生物膜层，经分子识别，发生特异性的生化反应，产生的信号继而被相应的化学或物理换能器转换成可定量、可处理的电信号，再经放大输出，就可从仪表上读取待测物的浓度。五、蛋白质工程

通过修饰基因的