第七章发酵工程技术概论

生物制药第七章发酵工程技术概论第一节概述第二节优良菌种的选育第三节发酵的基本过程第四节发酵方式第五节发酵工艺控制第六节发酵产物的提取第七节发酵设备第八节基因工程在发酵工程中的应用第九节发酵工程的发展展望第一节概述一、发酵工程（fermentationengineering），又称微生物工程：通过微生物完整的细胞自催化完成生物化学反应过程，微生物既能正常生长又能过量积累目的产物，提供工业产品。包括：抗生素、氨基酸、维生素、有机酸、酶制剂、蛋白质、基因工程药物、核酸类物质等。抗生素、氨基酸、酶制剂等产品为什么能通过微生物发酵来生产？这与微生物的生长和代谢特点有什么关系？某些微生物因争夺生存环境或营养物，会产生抗生素将其他种类的微生物杀死。微生物会产生蛋白酶、纤维素酶和淀粉酶，将营养物质水解成可吸收的小分子多肽或氨基酸、葡萄糖。微生物细胞会通过合成或分解代谢生产它必需的一些物质，包括氨基酸、核苷酸等。二、发酵工程发展的4个阶段第一阶段---天然发酵阶段：发酵技术开始于家庭小制作，传统的酿酒、制酱等。技术进步缓慢，完全是经验式的，并不知道其中的原理。1675年荷兰人列文虎克发明了显微镜。法国巴斯德在1857~1876持续研究发酵作用。第二阶段---传统发酵工业阶段：开始了解发酵现象的本质，采用开放式的发酵方式，生产过程及设备较为简单，规模不大。1900~1940人工控制微生物发酵过程（纯培养阶段），新产品酵母、甘油、乳酸、柠檬酸、丙酮和丁醇（第一个工业发酵产品）第三阶段---现代发酵工业阶段：通气搅拌技术阶段（深层通气培养法），技术要求高、发展速度快；生产规模大；菌种生产能力大幅提高，新产品、新技术、新设备的应用达到前所未有的程度。1942年青霉素工业化生产。第四阶段---生物技术产业阶段：利用基因工程菌进行发酵。三、发酵工程的研究内容生产菌种的培养和选育（菌种）培养基制备和灭菌（培养基）发酵条件的优化与控制（通气搅拌、溶氧、发酵及条件的优化、发酵过程参数控制、反应器的设计）产物的分离、提取与精制等（纯化）发酵工业的生产水平取决于三个要素：

生产菌种、发酵工艺、发酵设备第二节优良菌种的选育一、菌种选育的物质基础：遗传物质（DNA）二、自然选育不经过人工处理，利用微生物的自然突变进行菌种选育的过程正变菌株：生长良好、生产水平提高、对生产有利的变异个体负变菌株：生产能力下降、形态出现异性，生产水平下降，菌种退化特点：纯化菌种、防止菌种衰退、稳定生产水平、提高产物产量；但效率低、进展慢，通常将自然选育和诱变育种交替使用三、诱变育种

用人工方法来诱发突变是加速基因突变的重要手段，突变部位一般是在遗传物质DNA上，因此突变后性状能稳定的遗传。（一）方法和原理1.诱变机制（1）微小损伤突变：碱基置换、移码突变（2）染色体畸变：由于遗传物质的缺失或重排造成（易位、倒位、缺失、重复）（3）染色体组突变：指由有丝分裂或减数分裂异常而产生的染色体数目或组数的变化。2.诱变剂及作用方式：诱变剂：能诱发基因突变并使突变率提高到超过自发突变水平的物理化学因子。（1）物理诱变剂

紫外线、x射线、γ射线、快中子、α射线、β射线和超声波等。（2）化学诱变剂金属离子、一般化学试剂、生物碱、抗代谢物、生长刺激素、抗生素、高分子化合物、杀菌剂、染料等。对DNA的作用形式：与一个或多个核酸碱基起化学反应，引起DNA复制时碱基配对的转换而导致变异；如亚硝酸、硫酸二乙酯等与天然碱基相似的类似物掺入到DNA分子上引起的；如5-溴尿嘧啶、8-氮鸟嘌呤等DNA分子上减少或增加一两个碱基引起碱基突变点以下的全部遗传密码转录和翻译的错误---移码突变。如吖啶类物质三、诱变育种（二）诱变和筛选诱变---以合适的诱变剂处理细胞悬浮液包括：出发菌株的选择---诱变剂种类和诱变剂剂量的选择---合理的使用方法筛选---用合适的方法淘汰负变异株，选出性能优良的正变异株包括：初筛---重复筛选---突变株性能检测---直到获得新的优良菌株实用意义较大的初筛方法有以下几种：自身耐药突变株：耐受自身分泌的抗生素；开始合成抗生素的时间提早，产量也有所提高结构类似物或前体类似物的耐受突变株：解除反馈抑制，积累过量产物营养缺陷型突变株及其回复突变株：解除反馈抑制、阻断分支途径四、原生质体融合原生质体：除去细胞壁的细胞，或是被质膜所包围的裸露细胞。原生质体融合：指通过人为的方法，使遗传性状不同的两个细胞的原生质体进行融合，借以获得兼有双亲遗传性状的稳定重组子的过程。1.原生质体融合的一般程序：溶壁作用：细菌、放线菌（溶菌酶）、真菌（蜗牛酶）、霉菌（蜗牛酶、纤维素酶）原生质体在高渗溶液下用PEG作助融剂，将两种亲株原生质体进行融合在选择培养基上培养，挑出融合重组子2.影响融合的因素

菌龄：一般采用对数前期的菌体，原生质体形成率较高培养基成分：在限制性培养基上比在于完全培养基上原生质体形成效果好，可能是由于完全培养基中的有机成分或某些金属离子会引起细胞壁成分的改变，导致对溶壁酶敏感性的改变。PEG：相对分子质量（4000或6000）、浓度（30~40%）外界因素：高渗溶液配制、再生培养基中加入酵母膏促进再生速度、原生质体密度要适当3.原生质体融合育种意义：打破了微生物的种界界限，可实现远缘菌株的基因重组。可使遗传物质传递更为完整、获得更多基因重组的机会。去除了细胞壁屏障，融合重组频率比较高。可与其他育种方法相结合，如把常规诱变和原生质体诱变所获得的优良性状，组合到一个单株中。用途：改良菌株，提高代谢产物的产量，打破种属界限、产生重组子，有可能产生新的化合物。第三节发酵的基本过程

菌种---种子制备---发酵---发酵液预处理---提取精制

一、菌种对生产菌种的要求：产量高、生长快、性能稳定、容易培养生产菌种的保存：0~4℃休眠保存，砂土管或冷冻干燥管二、种子的制备使菌种繁殖，获得足够数量的菌体，以便接入发酵罐中三、发酵使微生物产生大量的目的产物，是发酵的关键阶段。参数：通气量、搅拌转速、罐压、罐温、培养基总体积、黏度、泡沫、菌丝形态、pH、溶氧浓度、排气中二氧化碳含量等四、产物提取发酵液的预处理和过滤，提取，精制第四节发酵方式一、分批发酵将全部物料一次投入到反应器中，经灭菌、接种、发酵后再将发酵液一次放出的操作过程。特点：（1）整个培养系统与外界没有其他物质交换（O2、CO2、消泡剂、酸碱除外）（2）整个过程中菌的浓度、营养成分的浓度和产物浓度不断变化，是一种非稳态的培养方法

分批培养的优缺点优点：操作简单，周期短，染菌机会少，生产过程和产品质量容易掌握。缺点：产率低应用广泛，改善中（在线监测，计算机控制）二、连续发酵微生物培养到对数生长期时，在发酵罐中不断添加新鲜的培养基，同时不断放出代谢物，使微生物在近似恒定状态下生长的培养方式。特点：菌浓度、产物浓度、限制性基质浓度均处于恒定状态。应用在废水处理、葡萄糖酸发酵、酒精发酵等工业中连续发酵的优缺点优点：操作稳定，利于机械化、自动化；控制稀释速率可以使发酵过程最优化，发酵周期长，产量高缺点：长期连续发酵会引起菌种退化，降低产量，染菌机会增加，对产品类型的适应性不广，对设备及附件要求高三、补料分批发酵将种子接入发酵反应器中进行培养，经过一段时间后，间歇或连续补加新鲜培养基，使菌体进一步生长的培养方法。应用广泛，用于氨基酸、抗生素等工业补料分批发酵的优缺点优点：与分批发酵相比延长次级代谢产物的生产时间可避免在分批培养过程中因一次性投糖过多造成细胞大量生长，耗氧过多的状况达到高浓度细胞培养稀释有毒代谢产物优点：与连续发酵相比因为操作时间有限，降低了染菌，避免了遗传不稳定性最终产物浓度较高，有利于产物的分离使用范围广，在生产次级代谢产物和细胞高浓度培养中普遍采用。

缺点：由于没有物料取出，产物的积累最终导致生产速率的下降由于物料的加入增加了染菌机会第五节发酵工艺控制一、培养基的影响及其控制碳源：占菌体干物质的50%以上是碳主要功能：提供能源、菌体成分、产物碳架来源：糖类、脂肪、有机酸、碳氢化合物速效碳源：如葡萄糖，能较迅速的参与代谢、合成菌体和产生能量，并产生分解产物，有利于菌体的生长，但有的分解代谢产物对产物的合成可能产生阻遏作用；迟效碳源：如淀粉、乳糖、油脂等，被菌体缓慢利用，有利于延长代谢产物的合成，特别有利于延长抗生素的分泌期，为许多微生物药物的发酵所采用。氮源：占菌体干物质的10%主要功能：构成细胞物质、构成蛋白质等产物的成分来源：无机氮源、有机氮源（速效氮源氨基酸、玉米浆、迟效氮源黄豆饼粉、花生饼粉、棉籽饼粉）速效氮源：如氨基酸、玉米浆等，有利于菌体的生长；迟效氮源：如黄豆饼粉、花生饼粉等，有利于代谢代谢产物的形成无机盐和微量元素主要功能：构成菌体原生质的成分（S、P）、作为酶的组成部分或维持酶的活性（镁、铁、锌、钙、磷等）、调节细胞的渗透压（NaCl、KCl等）和pH，参与产物的合成水：物质溶解和生化反应的基础功能：机体的重要组成成分、参加一些代谢反应、良好溶剂和热导体二、温度的影响及其控制1.影响发酵温度变化的因素

（1）生物热：微生物在生长繁殖过程中产生的热能；与培养基成分、培养时间、呼吸强度有关（2）搅拌热：搅拌器转动引起的液体之间和液体与设备之间摩擦所产生的产生的热量（3）蒸发热：水分蒸发所需热能（4）辐射热：罐内外气温差使热能向大气辐射的热量2.温度的选择与控制（1）最适发酵温度的选择：最适生长温度、最适生产温度变温发酵，如青霉素发酵30℃5h---25℃35h---20℃85h---25℃40h---放罐；青霉素产量比25℃恒温发酵高14.7%（2）温度控制一般不需加热，冷却水（冷冻盐水）通过夹层循环冷却三、溶氧的影响及其控制1.溶氧的影响最适氧浓度：菌体生长或产物合成最适浓度范围临界氧浓度：满足微生物呼吸的最低氧浓度2.发酵过程的溶氧变化溶氧异常下降（污染好气杂菌，菌体代谢异常，设备故障）溶氧异常升高（污染噬菌体，菌体代谢异常）3.溶氧浓度的控制溶氧浓度决定因素：供氧和需氧两方面。供氧方面：调节搅拌转速调节通气速率需氧方面：菌体浓度：耗氧量、氧传递速率基质种类和浓度培养条件：如温度、中间补水等四、pH的影响及其控制1.pH对发酵的影响影响酶的结构和活性影响微生物对基质的利用速率和细胞的结构影响微生物细胞膜的电荷状况影响代谢方向2.pH的变化取决于所用的菌种、培养基的成分、培养条件3.发酵pH的确定和控制（1）发酵pH的确定：菌种、培养基组成、培养条件、温度微生物发酵的最适pH范围一般在5~8之间，根据实验确定，即配制不同初始pH的培养基，考察发酵情况。（2）发酵pH的控制常用的控制方法有：调整发酵培养基的基础配方达到适当配比，使pH变化在合适范围内通过加酸碱：硫酸铵、氨水采用中间补料的方法：如尿素第六节发酵产物的提取一、吸附法利用适当的吸附剂（活性炭、白陶土、氧化铝等），在一定的pH条件下，使发酵液中的抗生素被吸附剂吸附，然后改变pH，以适当的洗脱剂（一般是有机溶剂）把抗生素从吸附剂上解吸下来，以达到浓缩和纯化的目的。优点：操作简单，原料易解决，成本低缺点：吸附剂吸附性能不稳定，选择性不高，不能连续操作，影响环境卫生，所以一般不采用二、沉淀法是指利用某些抗生素具有两性的性质，使其在等电点时从溶液中沉淀出来或在一定pH条件下，能与某些酸、碱或金属离子形成不溶性或溶解度很小的复盐，使抗生素从发酵滤液中沉淀下来，以及改变pH等条件时，此种复盐又易分解或重新溶解的特性，来提取抗生素的一种方法。优点：设备简单，原料易解决，节省溶剂，成本低，收率高缺点：过滤较困难，往往和溶剂法结合使用

三、溶剂萃取法利用抗生素在不同的pH条件下以不同的化学状态存在，以及它们在水及与水不互溶的溶剂中溶解度的不同的特性，使抗生素从一种液体转移到另一个液体中去，以达到浓缩和提纯的目的。优点：产品纯度高，浓缩倍数大，能连续生产，周期短缺点：溶剂耗量大，成本高，设备要求高（溶剂回收，防火防爆）四、离子交换法利用某些抗生素能离解成阳离子或阴离子的特性，使其与离子交换树脂进行选择性交换作用，再用洗脱剂从树脂上将抗生素洗脱下来，以达到浓缩和提纯的目的。优点：成本低，设备简单，节省溶剂，操作方便缺点：周期长，pH变化大，不适于稳定性差的抗生素第七节发酵设备理想的微生物细胞生物反应器的基本要求生物反应器的材料无毒，稳定性好，一般用不锈钢制成密封良好，避免污染生物反应器的结构：满足传质、传热、混合的性能容器内表面光滑，无死角，利于清洁灭菌任何接口处都不能有泄漏搅拌器转速和通气应适当能自动控制和调节多种理化参数第八节基因工程在发酵工程中的应用一、基因工程在抗生素生产中的应用（一）提高抗生素产量1.

增加生物合成中限速阶段酶系基因的拷贝数2.

通过调节基因的作用：增加正调节基因或降低负调节基因的作用3.

增加抗性基因：有些抗性基因是和抗生素的生物合成基因连锁，它们的转录有可能也是紧密相连的，是激活生物合成基因进行转录的必需成分。（二）改善抗生素组分应用基因工程方法可以定向的改造抗生素产生菌，获得只产生有效组分的菌种。（三）改进抗生素生产工艺利用重组DNA技术，把血红蛋白基因克隆到生产菌种，提高传氧速率，解除供氧水平对高产发酵的限制。（四）产生杂合抗生素杂合抗生素是通过遗传重组技术产生的新的抗菌活性化合物。1.生物合成途径中某个酶基因突变：会使中间产物积累，也可能使合成途径越过变异的酶直接由后续酶作用进行生物合成，从而产生一系列新的抗生素衍生物。2.在生物合成途径中引入一个酶基因3.利用底物特