第三章基因工程所需的基本条件

1基

因

工

程选用参考书：华东理工大学张惠展2基因工程5

2

3

4

1

6

7

8

9

基因工程的基本概念基因工程的基本原理基因工程所需的基本条件基因工程的操作过程目的基因的克隆与基因文库的构建大肠杆菌基因工程酵母基因工程哺乳动物基因工程高等植物基因工程3第三章基因工程的基本条件C用于基因转移的受体菌或细胞B用于基因克隆的载体A用于核酸操作的工具酶4A用于核酸操作的工具酶限制性核酸内切酶DNA连接酶DNA聚合酶核酸酶核酸修饰酶5学习内容

重点讨论限制性核酸内切酶和DNA连接酶在DNA切割和连接中的应用，并简要介绍其他与基因克隆有关的其它的重要的酶。

6限制性核酸内切酶7一、限制性核酸内切酶是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并切割DNA双链的核酸内切酶。

（Restrictionendonuclease）82.性质内切酶主要来源于原核生物即在核酸分子链的内部制造切口的酶。形成5’-P和3’-OH末端

自我保护作用3.功能细菌的限制和修饰系统（R/M体系）1.来源910限制性内切酶将侵入细菌体内的外源DNA进行分解，切成小片断。（1）限制（Restriction）11细菌自身的DNA碱基被甲基化酶甲基化修饰所保护，不能被自身的限制性内切酶识别切割。（2）修饰（Modification）①Dam甲基化酶(DNAAdenineMethylase)GATC腺嘌呤N6位置引入甲基②Dcm甲基化酶(DNAcytosineMethylase)CCAGG或CCTGG序列在第二个胞嘧啶上C5位置上引入甲基1213（3）限制与修饰系统相关的三个基因（来自大肠杆菌K和B株）①hsd

R:编码限制性内切酶②hsd

M:编码限制性甲基化酶③hsd

S:编码限制性内切酶和甲基化酶的协同表达这类酶能识别DNA分子上的特定位点，并将双链DNA切断这类酶使DNA分子特定位点上的碱基甲基化，即起修饰DNA的作用。作用是协同上述两种酶识别特殊的作用位点。141973年H.OSmith和D.Nathans提议的命名系统，命名原则如下：二、限制性内切酶的命名用属名的第一个字母和种名的头两个字母组成3个字母的略语表示寄主菌的物种名，组成酶的基本名称。大肠杆菌（Escherichiacoli）用Eco表示；流感嗜血菌（Haemophilus

influenzae）用Hin表示152.

如果酶存在于一种特殊的菌株中，则将该菌株名的第一个字母加在基本名称后，若酶的编码基因位于噬菌体（病毒）或质粒上，则用一个大写字母表示此染色体外遗传成分。如HindⅡ：d菌株

EcoRI：抗药性R质粒

163.

如果一种特殊的菌株内有几种不同的限制与修复系统，用罗马字母表示该菌株中发现某种酶的先后次序。

如HindⅡ：d菌株中发现的第二个酶4.

所有的限制酶，除以上名称外还要冠以系统名称。限制性内切酶的系统命名为R，甲基化酶为M。如R.Hind

Ⅲ表示限制性内切酶

M.HindⅢ表示相应的甲基化酶实际应用中，R常被省略。17Ⅰ

型限制性内切酶目前鉴定出四种不同类型的限制性内切酶。主要的三种：三、限制性内切酶的类型Ⅱ

型限制性内切酶Ⅲ

型限制性内切酶18首先由M.Meselson和R.Yuan在1968年从大肠杆菌B株和K株分离的。1.Ⅰ型限制性内切酶的基本特性

如EcoB和EcoK。亚基R、M、S分别具有限制性内切酶、甲基化酶和DNA特异性位点识别活性19（1）识别位点序列EcoB：TGA(N)8TGCTEcoK：AAC(N)6GTGC未甲基化修饰的特异序列。20需ATP、Mg2+和SAM（S-腺苷甲硫氨酸）（3）辅助因子在距离特异性识别位点约1000—1500bp处随机切开一条单链，不产生特异片断，应用不大Recognizesitecut1-1.5kb（2）切割位点21首先由H.O.Smith和K.W.Wilcox在1970年从流感嗜血菌中分离出来。（1）识别位点序列识别双链DNA分子中4-8对碱基的特定序列未甲基化修饰的双链DNA上的特殊靶序列（多数是呈典型的旋转对称型的回文结构）。大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧与DNA的来源无关，即没有种的特异性。2.Ⅱ类限制性内切酶的基本特性

分离的第一个酶是HindⅡ基因工程用途最大22稀有切割限制酶（rarecutter）可以识别6个以上的核苷酸序列的少数的限制内切酶。如Not

I

（GCGGCCGC）某些限制性内切酶的识别序列中，某一个或两个碱基并非严格专一。如HindⅡ可识别4种核苷酸序列：

Y:C或TR:A或GGTYRAC-3’5’-23EcoRI5’-GAATTC-3’3’-CTTAAG-5’PstI5’-CTGCAG-3’3’-GACGTC-5’

产生粘性末端EcoRV5’-GATATC-3’3’-CTATAG-5’

产生平齐末端（2）切割位点切开双链DNA，形成粘性末端（stickyend）或平齐末端（bluntend）。如：识别位点处24含有几个核苷酸单链的末端。分两种类型：[1]粘性末端（stickyends，cohensiveends）ⅰ）5’端凸出（如EcoRI切点）ⅱ）3’端凸出（如Pst

I切点）255‘…G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C…5’EcoRI37℃5‘…G-C-T-G-OH

P-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-P

OH-G-C-T-C…5’

退火4-7℃5‘…G-C-T-G

A-A-T-T-C-G-A-G

…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A

G-C-T-C

…5’OHPOHPⅰ）5’端凸出（如EcoRI切点）265‘…G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G

…3’3‘…C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C…5’PstI37℃5‘…G-C-T-C-T-G-C-A-OH

P-G-G-A-G…3’3‘…

C-G-A-G-P

OH-A-C-G-T-C-C-T-C…5’

退火4-7℃5‘…G-C-T-C-T-G-C-A

G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G

A-C-G-T-C-C-T-C…5’OHPOHPⅱ）3’端凸出（如Pst

I切点）27i）不同的DNA双链：只要粘性末端碱基互补就可以连接。ii）同一个DNA分子内连接：通过两个相同的粘性末端可以连接成环形分子。这比连接两个平齐末端容易得多。[2]粘性末端的意义①连接便利2829B末端可以通过末端转移酶添加几个多聚核苷酸的尾巴（如dA和dT），即同聚物加尾造成人工粘性末端。A

末端可用DNA多核苷酸激酶进行32P标记。粘性末端可以用DNA聚合酶补平成平齐末端。②末端标记③补平成平齐末端30[3]平齐末端（bluntend）在识别序列的对称轴上同时切割5’-GATATC-3’3’--5’CTATAG如EcoR

V31PvuII等产生的平头末端5‘

…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G

…3’3‘

…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C…5’PvuII37℃5‘…G-C-T-C-A-G-OH

P-C-T-G-G-A-G

…3’3‘…C-G-A-G-T-C-P

OH-G-A-C-C-T-C…5’

[3]平齐末端（bluntend）在识别序列的对称轴上同时切割32[4]平齐末端的特点连接困难，连接效率低，只有粘性末端连接效率的1%，这种连接常出现多联体连接。粘性末端与平齐末端连接的处理方法ⅰ）添补法：利用DNA聚合酶Ⅰ(klenowfragment）将碱基添补到目的基因的粘性末端上。33ⅱ）削除(平)法利用S1和Bal31等核酸酶将目的基因粘性末端的单链突出部分削去，使其成为平齐末端34不同来源的酶，识别相同的序列，切割方式相同或不同。识别位点和切点完全相同如HindⅢ

和HsuIHindⅢ5’-AAGCTT-3’3’-TTCGAA-5’HsuI5’-AAGCTT-3’3’-TTCGAA-5’[5]同裂酶（Isoschizomer)①完全同裂酶：35XmaI5’-CCCGGG-3’3’-GGGCCC-5’SmaI5’-CCCGGG-3’3’-GGGCCC-5’识别位点相同，但切点不同。如XmaI和SmaI。②不完全同裂酶：36识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端。如BamHI、Bgl

Ⅱ、Bcl

I、XhoⅡ等5’-GGATCC-3’3’-CCTAGG-5’BamHIBclI5’-TGATCA-3’3’-ACTAGT-5’

5’-AGATCT-3’3’-TCTAGA-5’Bgl

Ⅱ5’-UGATCY-3’3’-YCTAGU-5’Xho

ⅡU代表嘌呤；Y代表嘧啶。[6]同尾酶(Isocaudamers）375’-GATC----3’3’----CTAG-5’

Sau3A同尾酶的粘性末端互相结合后形成的新位点一般不能再被原来的酶识别。5’-G3’-CCTAGGATCT-3’

A-5’BamHIBgl

Ⅱ5’-GGATCT-3’3’-CCTAGA-5’BamHIBgl

ⅡSau3A38限制性内切酶的识别和酶切活性一般在一定的温度、离子强度、pH等条件下才表现最佳切割能力和位点的专一性。如果改变反应条件就会影响酶的专一性和切割效率，称为星号（*）活性。所以一般使用专一的反应缓冲液。

[7]限制酶的酶活性①星号（*）活性39EcoRI和BamHI等都有*活性。在低盐、高pH（>8）时可识别和切割GAATTA、AAATTC、GAGTTC等GAATTCEcoRI：使用的时候要特别注意！740②诱发星号（*）活性的原因ⅰ）高甘油含量ⅱ）内切酶用量过大ⅲ）低离子强度ⅳ）高pHⅴ）含有机溶剂，如乙醇ⅵ）Mn2+、Mg2+、Cu2+、Zn2+等二价阳离子的存在酶量不宜过多，尽量遵循生产商推荐的反应条件41在离它的不对称识别位点一侧的特定距离处切割DNA双链。移动切割（shiftedcleavage):GACGCNNNNNHga

ICTGCGNNNNNNNNNN5’3’[8]Ⅱs型限制性内切酶42（3）Ⅱ型限制性内切酶不具有甲基化功能Ⅱ型酶的甲基化修饰活性由相应的甲基化酶承担。它们识别相同的DNA序列，但功能不同。如EcoRI限制性内切酶和EcoRI甲基化酶前者：5’-GAATTC-3’

3’-CTTAAG-5’后者：5’-GAA*TTC-3’

3’-CTT*AAG-5作用的位点也不相同43（4）II型限制性内切酶对单链DNA的切割定义为切割双链DNA，但有一些还可以特异识别并切割单链DNA的相应位点，只是切割效率比较低如：HhaⅠ切割单链DNA比切割双链DNA效率低50％443.Ⅲ类限制性内切酶

在完全肯定的位点切割DNA，但反应需要ATP、Mg2+和SAM（S-腺苷蛋氨酸）。在基因工程操作中用途不大。EcoP1:AGACCEcoP15:CAGCAG45核酸限制性内切酶的类型及主要特性特性

Ⅰ类内切酶Ⅱ类内切酶Ⅲ类内切酶限制和修饰活性单一多功能的酶内切酶和甲基化酶分开共同亚基的双功能酶内切酶的蛋白结构3种不同的亚基单一成分2种不同的亚基限制作用所需要的辅助因子ATP、Mg2+和SAMMg2+ATP、Mg2+和SAM寄主特异性位点识别序列EcoB：TGA(N)8TGCTEcoK：AAC(N)6GTGC

回文序列（Ⅱs型除外）EcoP1:AGACCEcoP15:CAGCAG46切割位点在距离识别位点至少1000bp处随机切开一条单链位于寄主特异性位点或其附近距寄主特异性位点3’端24－26bp处酶催转换不能能能DNA易位作用能不能不能甲基化作用的位点寄主特异性位点寄主特异性位点寄主特异性位点识别未甲基化的序列进行切割能能能序列特异的切割不是是是基因工程中的用途无用十分有用用处不大47四、限制性内切酶酶解反应条件1.标准酶解体系的建立

一个单位（U）的限制性内切酶定义：

在合适的温度和缓冲液中，在20μl的反应体系中，1h完全酶解1μgDNA所需要的酶量。推荐：稍过量的酶（2-5倍）和较长的反应时间482.酶解过程

配酶解体系混匀反应终止酶解结果鉴定49①酶解体系一般20μl，保证酶液体积不超过反应总体积的10%前提下，尽量降低反应总体积。加样顺序一般是：ddH2ObufferDNA酶

50大部分II型核酸内切酶需要相似的反应条件：Tris-HCl50mMpH7.5MgCl210mMNaCl0-150mMDTT1mM0-50mM

低盐酶100mM

中盐酶150mM

高盐酶Volume20-100mlTT37℃1-1.5hrDTT：二硫苏糖醇51②混匀移液枪吹打或手指轻弹管壁若底物分子很大（如基因组DNA），应避免强烈振荡。混匀后微量高速离心机进行短暂离心，使管壁液体全部下沉。52③反应终止三种方法：ⅰ)加乙二胺四乙酸（EDTA）至终浓度10mmol/L;加十二烷基硫酸钠（SDS）至终浓度0.1%(W/V)ⅱ)65℃加热20min或者70℃加热10minⅲ)酚/氯仿抽提螯合Mg2+53④酶解结果鉴定快速进行微型琼脂糖凝胶电泳观察然后决定是否终止反应54酶切后发现除了目的DNA条带外，还有其它条带酶存在“星号”活性，造成非特异性切割；不正确的操作，导致其它内切酶污染；底物DNA中可能存在其它DNA污染。电泳后电泳条带扩散，电泳条带移动距离异常

底物DNA不纯；内切酶不纯；酶蛋白自身或其它杂蛋白与DNA结合在一起使电泳条带移动距离异常553.限制性内切酶对DNA分子的消化

1986年J.A.McClarin等通过X射线晶体衍射发现Ⅱ型限制酶是以同型二聚体的形式与靶序列结合。CTTAAGGAATTC（1）内切酶与识别序列的结合模式

56内切酶在DNA上的所有识别位点都被切开12341234（2）完全消化57只有有限数量的酶切位点被切开通过缩短保温时间、降低反应温度、增大反应体积或减少酶量可达到局部消化的目的。123414（3）局部消化58（4）几种常用限制酶识别位点59604.限制性内切酶酶解反应中的注意事项

①大多数厂家供应的限制内切酶为浓缩液1U的酶液足以在1h内消化10μgDNA，酶和底物比例2-10U/ugDNA,避免使用过高的酶浓度②浓缩液使用前可用1×限制酶缓冲液稀释③限制性内切酶在含50%的甘油的缓冲液中，于-20℃稳定保存61DNA中的杂质如蛋白质、酚、氯仿、乙醇、SDS、EDTA等都会影响酶的活性。1.DNA的纯度五、影响限制性内切酶活性的因素①纯化DNA②加大酶的用量，1ugDNA用10U酶③延长保温时间④扩大反应体积（>20l）一般采取62需要合适的底物：底物（DNA）纯度要高.不能含有RNA和蛋白质;也不能含有过高的EDTA。更不能含有酚、氯仿、乙醇、SDS和其他有机试剂。DNA的浓度不宜过高，高浓度的DNA会使溶液的粘度增加从而抑制酶分子的扩散导致酶切反应不彻底。常为50ul内含1ugDNA。63大肠杆菌一般有两种甲基化酶修饰质粒：2.DNA的甲基化程度DNA腺嘌呤甲基化酶（DNAadeninemethylas,dam)（修饰GATC中的A）；DNA胞嘧啶甲基化酶（DNAcytosineethylas,dcm)（修饰CCA/TGG的C）。基因工程中必须使用甲基化酶失活突变的菌株。64不同的限制性内切酶的最适反应温度不同。大多数是37oC，少数要求40-65oC。每微克DNA用1～5单位的酶，保温1~2小时。酶最适温度oC酶最适温度oC酶最适温度oCApaIBclIMaeIITaqI30505065Apy

IBstE

IIMaeIII306055BanIMaeISmaI5045253.温度65是影响限制酶活性的重要因素4.缓冲液(Buffer)（1）缓冲液的化学组成MgCl2、NaCl/KCl：提供Mg2+和离子强度Tris-HCl：维持pH,大多数为7-7.6二硫苏糖醇（DTT）：防止酶氧化,保持酶稳定性牛血清白蛋白（BSA）等：中性蛋白质,防止酶在低浓度的蛋白质溶液中变性商品化的限制酶一般都带有专用缓冲液66（2）两种或两种以上的酶切割DNA样品①在相同的缓冲液中反应同时进行②若需要不同的缓冲液,采用3种方法ⅰ)先用要求低离子强度的酶切割（低盐酶）,再加NaCl调节离子强度,并用第二种酶切割（高盐酶）；ⅱ)先用一种酶切割,然后用2.5倍体积的乙醇沉淀酶解产物,

再重悬于另一种缓冲液中进行第二种酶切割；ⅲ)使用所有限制性酶的通用buffer,如KGB(谷氨酸钾

buffer),经适当稀释可达到各种限制性酶要求的buffer条件。67练习题何为限制性内切酶？有哪些类型，各有什么作用和特点什么是限制性内切酶的星号活性？受哪些因素影响？限制性核酸内切酶是由细菌产生的，其生理意义是【】

Ａ修复自身的遗传缺陷

Ｂ促进自身的基因重组

Ｃ强化自身的核酸代谢

Ｄ提高自身的防御能力

Ｅ补充自身的核苷酸消耗

68DNA连接酶69从细菌DNA环化现象推测，必定存在一种能把两条DNA双链连接到一起的酶。一、DNA连接酶（ligase)的发现DNA复制一定有断口DNA连接酶70DNA连接酶:一种能够催化在两条DNA链之间形成磷酸二酯键的酶1967年，世界上数个实验室几乎同时发现了一种能够催化在2条DNA链之间形成磷酸二酯键的酶，即DNA连接酶。

71（1）大肠杆菌连接酶1.两种共价连接DNA限制片段的DNA连接酶只能连接粘性末端，背景低，准确性高二、DNAligase的特点（2）T4噬菌体的连接酶不但能连接粘性末端；还能连接齐平末端72（1）必须是两条双链DNA（2）DNA3’端有游离的-OH，

5’端有一个磷酸基团（P）（3）需要能量动物或噬菌体中：ATP大肠杆菌中：NAD+2.连接条件73DNA连接酶的基本性质将DNA双链上相邻的3’羟基和5’磷酸基团共价结合形成磷酸二酯键，并使之修复T4-DNA连接酶5‘…G-C-T-C-T-G-C-A

G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G

A-C-G-T-C-C-T-C…5’OHPOHP5‘…G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C…5’nicknick74（4）DNA连接酶的反应条件Tris-HCl50-100mM，pH7.5MgCl210mMATP0.5-1mMDTT5mMVolume10-20mlTT4-15℃，4-16hr1UDNA连接酶的酶活性：在最佳反应条件下15℃反应1小时，完全连接1mgl-DNA（Hind

Ⅲ片段）所需的酶量。75如何连接由限制性内切酶切割形成片断的末端？76连接酶反应的最佳温度是37C。四、连接反应的温度1.最佳温度但在37℃下粘性末端的结合很不稳定。2.实用温度所以一般采用4~16C77增加插入片段与载体的接触机会，减少同一个分子末端自我连接的现象。1.DNA末端的浓度五、影响连接反应的因素10~20倍2.插入片段与载体的浓度比例两种构型：线状分子和环状分子与DNA浓度及DNA分子长度相关783.反应温度黏性末端：12～16℃平头末端：10～20℃4.ATP浓度一般，ATP最适的终浓度为0.5mmol/L.ATP浓度高至5mmol/L，影响平头末端的连接ATP浓度高至7.5mmol/L，抑制粘性末端及平头末端的连接。79六、DNA连接的反应体系酶切纯化后的DNA片断连接缓冲液DNA连接酶80从分子动力学的角度讲，由限制性核酸内切酶创造的粘性末端的连接属于分子内部的连接，而平头末端的连接则属于分子间的连接，因此后者反应速度要慢得多。七、平头双链DNA片段的连接操作81加大连接酶用量（10倍大于粘性末端的连接）

加大平头末端底物的浓度，增加分子间碰撞机会

加入10%PEG8000，促进大分子之间的有效作用

加入单价阳离子（NaCl），最终浓度150-200mM提高平头末端连接效率的方法包括：DNA聚合酶8283DNA聚合酶（DNApolymerase)能在引物和模板的存在下，把脱氧核糖多核苷酸连续地加到双链DNA分子引物链的3’－OH末端，催化核苷酸的聚合作用.84一、基因工程中常用的DNA聚合酶大肠杆菌DNA聚合酶2.Klenowfragment3.T7DNA聚合酶4.T4DNA聚合酶5.修饰过的T7DNA聚合酶6.逆转录酶7.TaqDNA聚合酶851.共同特点把dNTPs连续地加到引物的3’－OH端2.主要区别T7DNA聚合酶可以连续添加数千个dNTPs而不从模板上掉下来。其它几种DNA聚合酶只能连续添加10多个dNTPs就会从模板上解离下来。二、常用的DNA聚合酶的特点持续合成能力和外切酶活性不同。86DNA聚合酶3’5’外切酶活性5’3’外切酶活性聚合速率持续能力大肠杆菌DNA聚合酶低有中低Klenowfragment低无中低T4DNA聚合酶高无中低T7DNA聚合酶高无快高化学修饰T7DNA聚合酶低无快高遗传修饰T7DNA聚合酶无无快高逆转录酶无无低中TaqDNA聚合酶无有快高3.常用DNA聚合酶的特性比较871.Klenowfragment具有5’3’聚合酶活性和3’5’外切酶活性。（失去了5’3’外切酶活性）。（1）Klenowfragment的性质DNAPolIKlenowfragment(76KD）

枯草杆菌蛋白酶实际上是大肠杆菌DNA聚合酶IC端大片段，由Klenow通过枯草杆菌蛋白酶位点特异性降解而得三、DNA聚合酶在基因工程中的用途88①3’端补平5’5’klenow②DNA3’末端标记补平限制性内切酶切后形成的3’隐蔽端。在3’隐蔽端加上放射性标记的dNTP。klenow（2）主要用途893’隐蔽末端的DNA片断Klenowfragment补平根据末端的顺序选择一种-32P-dNTPs末端标记的DNA限制性内切酶切5’----G3’3’----CTTAA5’5’----GAA3’3’----CTTAA5’5’----GAATT3’3’----CTTAA5’5’----G3’3’----CCTAG5’5’----GG3’3’----CCTAG5’5’----GGATC3’3’----CCTAG5’EcoRIBamHI-32P-dATP-32P-dGTP25oC1h90③cDNA第二链的合成mRNAcDNA第一链逆转录cDNA第二链klenow5’3’3’5’5’3’引物91（1）T4DNA聚合酶的性质2.T4DNA聚合酶从T4噬菌体感染后的大肠杆菌培养物中分离纯化，由噬菌体基因43编码。有5’3’聚合酶活性和3’5’外切酶活性（降解单链更快）。①来源②酶活性92③特点A当没有dNTP时，T4DNA聚合酶行使3’5’外切酶功能，制造出3’隐蔽端。B如果只有一种dNTP，则降解到该dNTP的位置。C在四种dNTP均存在时，聚合活性占主导地位。935’5’3’3’5’5’3’3’T4DNA聚合酶无dNTPsT4DNA聚合酶有dNTPs5’5’94（2）T4DNA聚合酶的用途标记末端（取代合成法或置换合成法）用3’5’外切酶活性作用于所有末端形式的3’端（平端、3’隐蔽端、5’隐蔽端）制造出3’隐蔽端。再利用它的5’3’聚合酶活性补平，并加入放射性标记的dNTP。①补平隐蔽末端②DNA3’末端标记95酶切中间产生两个末端标记加入某种32P-dNTP和dNTPsT4DNA聚合酶（3’5’外切）DNA酶切片断T4DNA聚合酶（5’3’聚合）5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’内切酶切无dNTPsDNA修饰酶9697一、末端脱氧核苷酸转移酶1.来源小牛胸腺。2.组成大小两个亚基。3.特性5’3’DNA聚合酶活性（terminaltransferase）98②不需要模板！①需要3’—OH、二甲胂酸缓冲液。③底物可以是单链DNA、是3’—OH突出的双链DNA、平末端需Co2+激活，但反应效率低。④随机添加的dNTPs。如果只有一种dNTP，就添加上同聚物。DNA5’3’TTTdTTP

，末端转移酶994.末端转移酶的用途（1）同聚物加尾给外源DNA片断和载体分子分别加上互补的同聚物尾巴，以使它们有效地连接。外源DNA载体DNA5’3’5’3’CCCCCCGGGGGGdGTPdCTP末端转移酶100（2）再生酶切位点便于回收克隆片断。AAGCTTTTCGAA5’5’HindⅢ酶切ATTCGAAGCTTAKlenow补平101AAGCTTTCGAAGCTTTCGAAAAGCATTTTTCGAAGCTTTTTTCGAA末端转移酶dTTPAAAAAA外源DNA102（3）DNA3’－OH末端标记AAGCTTTTTTCGAAGCTTTTTTCGAAAAAAAAHindⅢ位点HindⅢ位点连接催化非放射性或放射性标记物掺入DNA片断的3’端。（生物素-11-dUTP等）103

二、碱性磷酸酶1.碱性磷酸酶种类从大肠杆菌中分离出来。Bacterialalkalinephosphatase，BAP（1）细菌性碱性磷酸酶（2）小牛肠碱性磷酸酶Calfintestinalalkalinephosphatase，CIP从小牛肠中纯化出来。具有抗热性。SDS中加热68oC可完全失活。1042.碱性磷酸酶的特性催化脱掉DNA（或RNA）5’端的磷酸根。3’P--OH5’3’HO--P5’5’3’HO--OH5’3’HO--OH碱性磷酸酶3.碱性磷酸酶的功能（1）防止线性化的载体份子自我连接105单一酶切口的载体的粘性末端容易自我连接。AAGCTTTTCGAAHindⅢ酶切A-OHTTCGA-PP-AGCTTHO-A碱性磷酸酶5’5’5’106A-OHTTCGA-OHHO-AGCTTHO-AOH与OH不能形成磷酸二酯键，所以不能自我连接。同一酶切后的外源DNA的5’端有P，能与脱磷酸的载体OH连接。107ATTCGAAGCTTAAGCTTAATTCGA连接酶-OH与-OH连不住其中每条链上都有一个nick，但转入细菌后会被修复。3’P-AGCTTA-OH5’3’HO-ATTCGA-P5’外源DNA108第五节核酸外切酶（Exonucleases）是一类从多核苷酸链的一头开始催化降解核苷酸的酶。一、单链DNA外切酶1.大肠杆菌核酸外切酶I（exoI）5’3’外切识别5’-OH2.大肠杆菌核酸外切酶Ⅶ（exoⅦ）5’3’、3’5’外切识别3’-OH、5’-P109二、双链DNA外切酶1.核酸外切酶Ⅲ（exoⅢ）3’5’外切识别3’-OH主要用途：在DNA双链的末